G蛋白门控内向整流钾通道在物质成瘾中的研究进展

茹琴，李超英，李毅

1江汉大学武汉生物医学研究院，武汉 430056 2武汉市精神卫生中心精神科，武汉 430012

物质成瘾(包括酒精、药物成瘾)是一种慢性复发性脑病，表现为强迫性觅药和对成瘾物质的持续渴求[1]。长期使用成瘾物质导致神经结构和功能可塑性改变，是产生强迫性觅药行为和复吸行为的主要原因，而特定脑区基因表达和功能的异常则是神经可塑性改变的分子基础。由于物质成瘾涉及的神经生物学机制十分复杂且尚未清楚，目前针对成瘾尚无有效的治疗对策。

钾通道活性的调节在中枢神经系统发挥着重要作用，某些钾通道对K+内流的通透程度大于外流程度，这类钾通道被命名为内向整流钾(inwardly rectifying potassium，Kir)通道[2]。目前已发现有15种Kir通道[3]，其中G蛋白门控的Kir(G protein-gated inwardly rectifying potassium channels，GIRK，Kir3.x)通道生理功能的改变与许多脑疾病的病理生理学过程相关联，在成瘾密切相关的奖赏系统如腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)和其主要投射区伏隔核(nucleus accumbens，NAC)、前额皮质(prefrontal frontal cortexes，PFC)等脑区均有表达，参与神经元兴奋性的调节，敲除GIRK通道会改变小鼠对成瘾物质如酒精、可卡因、甲基苯丙胺等的成瘾行为[2]，表明GIRK通道与成瘾行为关系密切，本文总结了GIRK通道在物质成瘾中的研究进展。

GIRK通道的结构特性、分布及调控

GIRK通道的结构特性目前已知GIRK家族有5种亚基，其中GIRK2还存在3种剪切突变体，GIRK通道以同源或异源四聚体的形式存在。GIRK亚基具有与其他Kir亚基相似的结构特征，C末端和N末端均位于胞内，有2个跨膜结构域M1和M2，由细胞外通道孔区(P或H5)相连，P区域作为“K+选择性过滤器”，和其他的K+通道拥有共同的特征序列T-X-G-(F/Y)-G，GIRK通道缺乏电压感受器区域，所以对膜电压不敏感。晶体结构分析显示，跨膜结构域M2形成的内在螺旋和胞内区的G环是K+门控的重要区域，其中M2区域中的1个高度保守的甘氨酸可以发挥类似“铰链”作用，使得M2结构域进行弯曲和旋转，允许内在螺旋扩张，使K+顺利通过。随机突变实验证明，在该甘氨酸附近引入脯氨酸使M2结构域结构扭结，可使GIRK通道持续开放；G环是胞内区最狭窄的部分，可允许K+通过，但水合K+则不能顺利通过[4]。

GIRK通道在中枢神经系统中的分布GIRK1～3亚基在脑内分布广泛，如在海马、皮层、小脑中都有表达，但在VTA尾状核的中型多棘神经元中没有表达[5- 6]。GIRK1亚基有内质网滞留信号，需要与其他亚基共表达才能定位到细胞膜上并形成具有功能的异源四聚体，GIRK1和GIRK2亚基在脑内某些区域有交叉分布，组成的异源四聚体被认为是GIRK通道在哺乳动物脑内的主要存在形式[7]。GIRK4仅分布在少数脑区，如在小鼠脑内主要分布在皮层深部的锥体神经元[8]。GIRK5目前只发现在非洲爪蟾卵母细胞中表达[9]。

GIRK通道在不同脑区的分布仍存在特异性。如GIRK2c和GIRK3亚基在VTA脑区多巴胺(dopamine，DA)神经元和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)神经元都有表达，而GIRK1亚基仅在GABA神经元有表达[10]，黑质致密部(substantia nigra compacta，SNc)的DA能神经元只表达GIRK2c和GIRK2a亚基组成的同源四聚体[11]。在大鼠海马CA1区域的神经元中GIRK1主要存在于树突、树突棘和胞体，而在下丘脑室旁核中GIRK1只表达在突触前膜，突触后膜无表达[12]。这些研究结果表明，GIRK亚基在脑内的分布不仅存在脑区和神经元的特异性，在不同脑区和不同的神经元上，GIRK亚基存在的亚细胞部位也不同，这可能与其发挥的生理学功能有关。

GIRK通道在中枢神经系统中的生理作用

尽管GIRK具有内向整流作用，但它们通常的生理作用是在接近静息膜电位水平上允许K+外流，在静息电位和引起神经元产生动作电位的膜电位之间这种外向的GIRK电流非常重要，这种超极化的K+电流可降低细胞的兴奋性；相反，在动作电位的下降支时，电压门控钾通道被激活，大量K+外流，使神经元重新极化，神经递质如GABA、DA通过激活相应的G蛋白受体激活GIRK通道，由于通过这些代谢型受体激活GIRK通道需要一定时间，比离子型受体的激活要慢，因此，这种慢抑制性突触后电流会对神经活动产生更持久的抑制作用[2]。将GIRK1、GIRK2、GIRK4和5-羟色胺1A受体共转染培养的海马神经元，在给予5-羟色胺后发现由于GIRK的激活而使神经元兴奋的阈值增加了2～3倍，最终抑制神经元的放电频率[13]。

目前，GIRK通道因受体激活产生抑制神经元作用主要有以下3种方式：(1)神经元自抑制：部分神经元会释放神经递质激活自身树突上的抑制性G蛋白偶联受体和GIRK通道，导致自抑制。例如，DA神经元的自受体主要由D2亚型受体(D2、D3和D4)组成，位于VTA和SNc的中脑DA神经元的胞体和树突，以及在投射区域的轴突末端，作为反馈调节因子，这些受体的激活可进一步调节GIRK通道活性，降低DA神经元兴奋性和DA释放[14]。虽然D2和D3受体均存在于多巴胺神经元上，绝大多数神经元自抑制被认为是通过D2受体介导。(2)神经元间抑制：在神经信号突触传递中，相邻神经元可释放神经递质激活突触后膜上的GABAB受体、D2受体或Ⅱ型代谢型谷氨酸受体mGluR2/3，进而激活GIRK通道。(3)神经网络抑制：如DA可先与DA神经元上的自受体和相邻神经元上的受体结合激活GIRK通道，影响DA释放，进而影响周围几十立方微米范围内的高亲和力DA受体，并因此可能同时影响许多邻近神经元上的成千个神经突触[14]。

GIRK通道在物质成瘾中的研究进展

目前认为GIRK通道调节神经元的兴奋性主要是减少神经元峰电位的频率，通过产生慢抑制性突触后电位抑制神经元的兴奋性，调节神经突触可塑性。中脑边缘多巴胺系统的过度激活是成瘾性药物引起奖赏效应或正性强化作用的最后公共通路。GIRK通道可以抑制神经元的兴奋性这一重要生理功能使得其可能成为抑制物质成瘾的作用靶点。研究表明，GIRK通道在中脑边缘多巴胺系统均有表达，成瘾行为会改变GIRK通道的活性和表达，GIRK通道也通过影响突触可塑性参与调节实验动物对成瘾物质的觅药、渴求、复吸等行为反应[15- 16]。

GIRK通道与酒精成瘾酒精主要通过影响GABA受体或GABA释放，间接促进VTA中DA能神经元的放电从而增加投射区NAC中DA的释放，上调奖赏环路的功能引起成瘾。研究发现，酒精可以激活大鼠中脑DA能神经元上GABAB受体偶联的GIRK通道，增强GABAB受体激动剂巴氯芬(Baclofen)产生GIRK通道电流(IBaclofen)，进而浓度依赖性地增加GABAB受体介导的突触后抑制电位的振幅，引起突触可塑性改变，从而调节大鼠酒精摄入量，并改变大鼠精神和运动表现[17]。进一步研究发现，两个相邻的GIRK亚基胞内区可以形成疏水性酒精口袋结构，由N末端结构域、1个亚基的βD-βE环和相邻亚基的βL-βM环3个结构元件构成，酒精口袋是GIRK通道的酒精依赖性激活位点[18- 20]。敲除GIRK3亚基可在不影响酒精代谢情况下显著增加小鼠的酗酒行为，而在VTA区域过表达GIRK3亚基则能逆转敲除小鼠的酗酒行为，也能降低野生型小鼠对酒精的摄取，敲除GIRK3亚基还能降低酒精引起的VTA神经元兴奋性和伏隔核DA释放，使小鼠中脑边缘多巴胺系统对酒精的反应性降低，表明在酗酒条件下GIRK3亚基的表达水平与酒精摄取量呈负相关[21]。与野生小鼠相比，敲除GIRK3亚基能增加小鼠酒精条件性位置偏爱行为[22]，而GIRK2亚基敲除小鼠不能建立酒精条件性位置偏爱行为[23]，但敲除GIRK2基因能增加酒精成瘾小鼠的酒精饮用量[24]。这些研究表明，在酒精诱导的条件性位置偏爱行为中，GIRK2和GIRK3可能发挥相反的作用，GIRK通道亚基的组成可能影响小鼠对酒精的敏感性。

GIRK通道与阿片类物质成瘾阿片类药物进入体内后与不同脑区内的抑制性GABA能神经元突触前膜上的阿片受体结合，通过激活阿片受体实现对GABA能神经元的突触前抑制，从而降低GABA能神经通路对VTA中DA能神经元的抑制作用，导致奖赏环路被激活。GIRK通道与μ、κ和δ阿片受体偶联，前期动物实验和临床研究显示，GIRK通道不仅参与阿片类药物的镇痛作用，也参与阿片类物质成瘾。体内外实验都证明，吗啡能够上调海马神经元树突棘上GIRK2的表达[25]，推测GIRK信号通路的可塑性可能参与吗啡成瘾行为。利用化学遗传学特异性敲除VTA中GABA神经元GIRK2亚基，对吗啡诱导的行为敏化无影响，而特异性敲除DA能神经元的GIRK2亚基则能增强吗啡诱导的行为敏化[26]，表明在VTA中是DA能神经元上而非GABA神经元上的GIRK2亚基参与调节吗啡诱导的行为敏化，GIRK通道似乎以细胞和亚基依赖的方式调节阿片类物质诱导的行为敏化。

有文献报道同时敲除GIRK2/3亚基能在不影响镇痛效果的情况下减轻吗啡戒断症状[27]，可能与敲除GIRK2/3亚基抑制了吗啡导致的蓝斑核(locus coeruleus，LC)兴奋性突触后电流振幅增加和自发放电增加有关[28]，表明敲除GIRK2/3亚基可通过改变LC突触可塑性减轻吗啡戒断症状。但也有临床研究显示，GIRK2亚基SNP位点突变后，在减轻戒断症状的同时会降低阿片类药物的镇痛作用，提高患者对阿片类药物需求量[29]。由于相关报道较少，GIRK通道在缓解阿片类物质戒断症状方面的作用机制及与阿片类药物镇痛作用之间的关系还不明确。

GIRK通道与镇静催眠药成瘾镇静催眠药抑制中枢神经系统功能，用于减少焦虑或诱发睡眠，但巴比妥酸盐、苯二氮卓类药物和唑吡坦等镇静催眠药的滥用倾向呈增加趋势，尤其是苯二氮卓类药物。美国疾病预防与控制中心的数据显示，近年来使用或过量使用苯二氮类药物的死亡人数均呈上升趋势[30- 31]。有研究表明，GIRK3亚基与镇静催眠药的滥用密切相关，降低GIRK3亚基mRNA表达水平或敲除GIRK3亚基可在不影响药物镇静催眠效果的情况下有效缓解戊巴比妥和唑吡坦戒断症状[32]，提示GIRK3亚基参与镇静催眠药的急性戒断过程。

GIRK通道与中枢神经兴奋剂成瘾神经兴奋剂如可卡因和甲基苯丙胺等可直接抑制多巴胺转运体功能，促进DA释放并抑制重摄取，增加突触间隙DA水平，使机体活动性增加并产生成瘾行为。与野生型小鼠相比，整体敲除GIRK1或GIRK2亚基均能显著增强可卡因诱导的行为敏化，这可能与敲除GIRK1或GIRK2亚基能够增加伏隔核突触密度、增强兴奋性信号传递有关[33]，但GIRK3和GIRK2/3双敲除对可卡因诱导的行为敏化无明显影响[33- 34]。进一步实验结果显示，特异性敲除VTA中DA能神经元GIRK2亚基或GIRK通道调节蛋白SNX27可以显著抑制IBaclofen，增强可卡因急性给药诱导的自发活动增加或慢性给药诱导的行为敏化[35- 36]。敲除SNc和VTA中DA能神经元上SNX27能显著抑制致GABAB受体和D2受体激活的GIRK电流，也可增强可卡因诱导的行为敏化[37]。这些研究结果表明，敲除GIRK亚基或其调节蛋白可能通过解除抑制性G蛋白受体如GABAB受体对奖赏信号通路的负反馈作用，增强可卡因行为敏化过程，但这3种GIRK亚基之间可能存在复杂的相互作用机制。然而关于GIRK亚基对可卡因诱导自身给药行为影响的研究，结果却不尽相同。整体敲除GIRK2或GIRK3和GIRK2/3双敲除均能显著抑制低剂量可卡因诱导的自身给药行为，单基因敲除的抑制效果反而优于双基因敲除[34]，但特异性敲除VTA中DA能神经元GIRK2则可增强可卡因诱导的自身给药行为和可卡因的摄入[36]。整体敲除和神经元特异性敲除造成的实验结果差异可能是由于GIRK通道在脑内广泛表达，整体敲除会导致中枢神经系统其他信号通路产生适应性改变，神经元特异性敲除实验的结果或许更能真实反映GIRK通道在可卡因成瘾中的作用。

上述研究显示GIRK通道表达水平的变化能显著影响实验动物的成瘾行为，此外GIRK通道功能的改变如GIRK电流的变化也在成瘾过程中发挥作用。急性注射可卡因和甲基苯丙胺能降低VTA中DA能神经元GIRK通道的表达，D2受体依赖性抑制DA能神经元上GABAB受体偶联的IBaclofen，从而减少抑制性突触后电流，引起突触可塑性改变[38- 39]。慢性给药实验也发现，连续5次腹腔注射甲基苯丙胺会抑制GABAB受体偶联的IBaclofen，这种抑制作用是由DA能神经元GIRK通道表达下调引起的，并需要D1和D2受体的激活，进一步研究发现甲基苯丙胺对IBaclofen抑制作用与GIRK3亚基表达水平密切相关[40]。同时，在甲基苯丙胺自身给药模型小鼠上也发现类似结果，即甲基苯丙胺能抑制VTA和SN中DA能神经元上D2受体和GABAB受体偶联的IBaclofen[41]。这些研究表明，急慢性给予可卡因和甲基苯丙胺等神经兴奋剂都能抑制VTA中DA能神经元上GABAB受体偶联的IBaclofen，增加DA神经元的兴奋性，进而引起突触可塑性改变，从而引起成瘾行为。

除了影响DA能神经元上的GIRK通道外，可卡因和甲基苯丙胺急慢性注射还能显著抑制VTA中GABA神经元上GABAB受体偶联的IBaclofen。与DA能神经元不同的是，甲基苯丙胺对GABA神经元上IBaclofen的抑制作用与GIRK通道表达水平无关，但与GABAB受体783位丝氨酸的去磷酸化水平和进而引起的GABAB受体和GIRK通道的内化有关；给予磷酸酯酶抑制剂则能逆转甲基苯丙胺对IBaclofen的抑制作用，这种抑制作用在停药后还能持续1周[38]，可能与甲基苯丙胺改变了蛋白激酶和磷酸酯酶的分布有关。DA能神经元有持续性放电和爆发式放电两种模式，其中爆发式放电会使神经元向突触间隙释放更多的DA，GABAB受体信号通路控制这两种放电模式，VTA的GABA神经元可以释放GABA，通过激活VTA中DA能神经元上GABAB受体进而减少DA能神经元的爆发式放电过程，从而抑制DA的释放。可卡因和甲基苯丙胺等显著降低VTA中GABA神经元上抑制性GABAB受体偶联的IBaclofen，增加GABA的释放，激活DA能神经元上的GABAB受体，抑制DA能神经元的爆发式放电，从而降低DA能神经元的兴奋性。这种神经兴奋剂引起的VTA中GABA神经元GABAB受体偶联的GIRK通道电流下调，可能代表早期神经元的“保护”或自我适应过程，这也能部分缓解成瘾药物引起的VTA中DA能神经元的过度兴奋。

GIRK通道与其他物质成瘾虽然目前没有发现尼古丁激活的烟碱型乙酰胆碱受体与GIRK通道之间存在联系，但日本一项临床研究显示，GIRK2通道rs2835859位点基因突变患者对疼痛敏感性降低，但对尼古丁有较高的易感性[42]，巴氯芬可能通过激活与GABAβ受体偶联的GIRK通道，抑制尼古丁成瘾大鼠的复吸行为[43]，这些研究表明GIRK通道信号通路与尼古丁成瘾间也可能存在联系，但需要更多实验证据验证。另外，由于GIRK通道可被内源性大麻素激活，并且参与大麻素的镇痛效应，所以GIRK通道可能介导四氢大麻酚(大麻的主要成分)的奖赏效应。γ-羟基丁酸成瘾也与激活GIRK信号有关[44]。

独特的神经元分布和功能敏感性使得脑内的GIRK通道功能具有明显的脑区和细胞特异性。基于它们对不同类型成瘾物质的整体敏感性，GIRK通道很可能成为不同物质成瘾过程中的共同靶点，影响成瘾治疗效果。

GIRK通道调节剂治疗成瘾临床应用进展

GIRK通道与成瘾行为关系密切，GIRK通道的调节剂也被尝试用于治疗成瘾行为[45]。例如巴氯芬能特异性激活GABAB受体，进而激活其偶联的IBaclofen，可卡因急性或慢性给药能显著抑制IBaclofen，增强DA神经元兴奋性引起成瘾[39]。动物实验证明，巴氯芬能降低成瘾大鼠对可卡因的渴求和复吸行为[45]；酒精可以激活IBaclofen，引起突触可塑性改变，巴氯芬干预则能缓解酒精戒断症状[46]。文献报道敲除GIRK1或GIRK2亚基能显著抑制巴氯芬导致的小鼠脑电波、VTA中DA和GABA神经元GIRK电流的变化和共济失调等行为学的改变[26，47- 49]，表明激活GABAB受体偶联的IBaclofen很可能是巴氯芬改善成瘾行为和缓解戒断症状的重要机制之一。目前研究者已开展多项巴氯芬改善物质成瘾的临床研究。2007年Addolorato等[50]报道了巴氯芬治疗酒精成瘾的随机双盲临床试验，结果显示71%的治疗组患者能达到并维持戒酒期(安慰剂组为29%)，治疗组患者的累积戒酒时间为安慰剂组的两倍，表明巴氯芬能有效延长酒精依赖症患者的戒酒期，具有治疗酒精成瘾的潜力。随后多项临床研究也得到类似的结果，证明巴氯芬能缓解酒精戒断症状，降低渴求和再次酗酒率，延长戒酒期[51- 55]。2014年巴氯芬被法国国家药品和健康产品安全局批准用于酒精成瘾的治疗。但法国毒物控制中心对2008至2013年期间294例使用巴氯芬治疗酒精成瘾的患者进行了回顾性调查，结果显示74.8%的治疗者曾尝试用高剂量巴氯芬自杀，60%企图自杀者患有严重精神的精神疾病，这项调查表明酒精依赖症患者的巴氯芬中毒情况严重，由于成瘾者自杀意念比一般人群中更普遍，因此巴氯芬的临床使用需要严密监测[56]。美国关于巴氯芬治疗酒精成瘾的临床试验很多，但结论仍存在争议。有文献报道巴氯芬虽然不能降低酒精强化效应和成瘾者渴求感，但能影响成瘾者对酒精的生理和主观感受[57]，也有研究显示巴氯芬在治疗酒精成瘾方面没有疗效[58- 59]，因此，巴氯芬能否在全球范围内广泛用于酒精成瘾治疗还需要更多的临床试验证据。

此外，巴氯芬也被用于治疗可卡因成瘾。Shoptaw等[60]对70例可卡因成瘾者进行了16周的随机双盲试验，结果显示，巴氯芬在减少可卡因使用量方面有初步临床疗效，对于每日吸食量较低的慢性可卡因成瘾者来说，巴氯芬的疗效尤其明显，但在降低渴求方面，治疗组和安慰剂组相比没有显著性差异。Kahn等[61]随后对160例严重的可卡因成瘾者进行了12周的随机双盲试验，但结果与Shoptaw等[60]的研究相反，即在减少可卡因使用量方面，治疗组和安慰剂组相比没有显著性差异，推测巴氯芬不能降低严重可卡因成瘾者的使用量，或是需要更高的剂量才能发挥作用。这些研究表明巴氯芬可能具有治疗可卡因成瘾的潜力，但其疗效需要更多的临床试验验证。

GIRK通道激动剂或拮抗剂研究进展

鉴于GIRK通道在神经系统中的重要作用，寻找GIRK通道特异性激动剂和拮抗剂也成为研究热点。小蜂毒肽tertiapin可结合到GIRK通道的胞外区，阻断GIRK通道[62]，已成为研究脑内GIRK通道的生理功能和机制的重要分子。柚皮素是一种从葡萄柚中提取的黄酮，已被鉴定为GIRK通道激动剂，柚皮素可能通过与GIRK1胞外芳香族酪氨酸残基(Y148和Y150)结合发挥激动作用，这也是tertiapin的结合位点[63]。由此可知，尽管目前柚皮素激活GIRK1亚基的具体机制尚不清楚，其和tertiapin可能共享同一个结合位点。NTC- 801是一种苯并吡喃衍生物，其阻断GIRK1/2通道的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)为24 nmol/L，阻断GIRK1/4通道的IC50仅为0.7 nmol/L，表明其与GIRK1/4通道具有更好的亲和力[64- 65]。ML297是第1个高效选择性GIRK通道激动剂，激活GIRK通道的半数有效浓度(median effective concentration，EC50)为233 nmol/L，此前发现的其他激动剂的EC50均为μmol/L级，ML297仅对含有GIRK1的异源四聚体有激活作用，对GIRK2无激活作用[66]。进一步研究确定GIRK1亚基中苯丙氨酸和天冬氨酸(孔螺旋中的F137和M2中的D173)是ML297选择性激活含GIRK1亚基通道的关键氨基酸，将GIRK2中相同位点的氨基酸突变为苯丙氨酸和天冬氨酸后，ML297就可以激活GIRK2通道[67]。由此可见，这些氨基酸可能决定了不同GIRK亚基间选择性、门控特性和内向整流特性之间的差异。

目前研究者多采用基因工程的方法，通过敲除或过表达GIRK亚基研究GIRK通道与物质成瘾的关系，这类小分子GIRK通道的激动剂和拮抗剂应用报道还较少，但也为发现新的物质治疗药物的研发提供了新思路。

问题与展望

在不同脑区神经元上的特异性分布及功能敏感性赋予GIRK通道独特的功能，尽管参与不同成瘾过程的GIRK亚基不同，涉及的核团和神经元种类不同，GIRK通道在不同成瘾物质引起的成瘾行为中都发挥重要作用，可能成为成瘾过程中的共同靶点。然而目前仍有许多问题尚未得到解决，包括：(1)前期研究多采用整体动物基因敲除，利用化学遗传学和光遗传学特异性敲除特定细胞上的GIRK亚基可能有助于进一步了解GIRK通道在成瘾行为中的作用；(2)现有研究多集中在经典的中脑边缘多巴胺系统，其他核团如外侧缰核和海马也在成瘾记忆形成中发挥重要作用，可以利用条件性敲除或逆行追踪研究这些非多巴胺脑区的GIRK通道在成瘾中的作用；(3)ML297可以特异性激活GIRK1亚基，有助于研究GIRK1在成瘾中的作用，而目前尚无GIRK2和GIRK3特异性抑制剂或激动剂，除了基因表达方面的干预，高特异性的小分子抑制剂或激动剂的研发对研究GIRK通道在成瘾行为中的作用也十分必要。目前除了巴氯芬，尚没有其他GIRK通道抑制剂或激动剂应用于临床，现有的小分子调节剂如ML297还需要详实临床前研究数据才有可能应用于临床。因此，在今后的研究中深入探讨GIRK在成瘾过程的生理和病理意义，将有助于进一步了解物质成瘾的发病机制，并为临床上的针对性治疗提供理论依据。