心肌肥厚动物模型及代偿机制研究进展

刘梦迪张连峰吕 丹*

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021；2.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

心肌肥厚通常是作为对血流动力学压力或心肌损伤的适应性反应而引发的[1-2],表现为心肌质量增加,收缩力增加,对增强心脏功能、降低心室壁张力和耗氧量具有补偿作用,有助于维持心输出量,维持正常的血液循环,是一种缓慢发展的有效代偿功能。 在细胞学方面,心肌肥厚的特点是心肌细胞变大,肌节结构分离,蛋白质合成增强以及胎儿基因重新表达。 在心肌肥厚的超声心动图中可观察到增厚的室间隔,缩小的左心室腔,变窄的左室流出道,且二尖瓣前叶收缩期前移,主动脉瓣收缩中期呈现出部位性关闭等。 虽然心肌肥厚最初可能是代偿性和适应性的,在心血管疾病的早期阶段可以提供某些益处,但长期病理学心肌肥厚将改变心脏基因的表达,细胞间肌纤维和血管周围纤维化及功能障碍,从而导致失代偿,心力衰竭和猝死的发生率增加。 目前的研究表明,肾素-血管紧张素系统抑制剂(renin-angiotensin system inhibitor,RASI)、β 受体阻滞剂(beta blocker,BB)、血管紧张素转化酶抑制剂、他汀类药物等对心肌肥厚有一定的治疗效果。 RASI 和BB 联合拮抗交感神经和肾素-血管紧张素系统,对心室的重构、新功能的改善以及远期预后等方面有益[3-7]。 本文对心肌肥厚动物模型及代偿失代偿分子机制的研究进展进行了归纳总结。

1 心肌肥厚动物模型及制备方法

心肌肥厚动物模型已经在小鼠、大鼠、犬、羊、猪等物种中建立,小鼠及大鼠的优点是基因背景信息齐全,商品化试剂丰富,同时经济且易饲养。 大动物的优点是操作容易,重复性好,对动物造成的损伤较小,存活率高,并且更符合人体解剖和血流动力学的特点,尤其是猪。

1.1 大鼠心肌肥厚模型

目前大鼠模型在心脏损伤相关研究中仍占主导地位,它们较大的尺寸极大地促进了手术操作和术后研究,其心肌肥厚模型的建立采取物理法、化学法和生物法。

1.1.1 物理法

物理法包括压力超负荷法、容量负荷法、心肌梗死和运动致心肌肥厚[3]。

压力超负荷法主要包括:(1)主动脉缩窄法(transverse aortic constriction,TAC):在大鼠无名动脉和左颈总动脉之间结扎主动脉弓,经过4 周形成明显的左心室心肌肥厚；(2) 腹主动脉缩窄法(abdominal aortic constriction,AAC):在大鼠的腹腔动脉和肠系膜前动脉之间进行结扎,得到重建后的直径为0.55 mm。 在AAC 术后进行超声心动图检查,同时结合组织学和血浆脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平综合评判,术后第4 周诱导左心室心肌肥厚。 (3)肾型高血压法[8-10]:把左肾动脉用内径为0.2 mm 的银夹夹住,造成肾缺血,使肾内产生肾素,增加血内的血管紧张素Ⅱ含量,致使高血压形成,长期刺激而产生心肌肥厚。 术后避免感染需给予青霉素,4 周后在清醒状态无创收缩压≥160 mmHg 者为造模成功。 该方法的优点在于同人类的病理模型相似,由于高血压比较稳定,可逐渐形成心肌肥厚,因此该模型也常被用来研究心肌肥厚。

容量负荷法包括:(1)动静脉造瘘法:腹部正中进行切口,在其左肾动脉下面分离出腹主动脉和下腔静脉,血管夹夹断血流。 9 号静脉注射针依次穿过下腔静脉壁和动静脉联合壁,鲜红色动脉血流出后将针头退出,然后进行缝合。 造瘘成功的标志为松开血管夹后,见下腔静脉红色血流,这种方法4～5周可形成心肌肥厚；(2)DOCA 盐敏感性高血压法[11]:切除大鼠的左肾,在术后1 周皮下植入含去氧皮质醇(deoxycortisol,DOCA) 的微泵或注射DOCA,按照50 mg/kg 连续每天给药,持续9 周,术后8 周便可形成心肌肥厚。

心肌梗死致心肌肥厚采用冠状动脉结扎、堵塞或促进冠状动脉血栓形成等方法[12-13],有研究显示在结扎冠状动脉左前降支一周后可见心肌肥厚。

运动致心肌肥厚[13-14]包括:(1)跑轮训练致心肌肥厚:在有一定阻力的跑轮上无外界干扰进行自主训练,跑步距离在2～4 周达到每天10 ～15 km,此时距离最长,之后为每天小于4 km,3 ～4 周可观察到心肌肥厚；(2)游泳训练致心肌肥厚:对大鼠进行每日2 次,每次1 h,每周5 d,为期8 周的游泳训练,可见发生显著的心肌肥厚。

1.1.2 化学法

化学法是利用化学试剂或药物对动物机体产生作用而诱发动物疾病[15-17]。 化学法诱发心肌肥厚主要是药物诱导法,该方法需要的时间短、操作简便且心肌肥厚可很快形成、出现明显的心肌病变。 具体操作过程即给受试动物注射或在皮下植入渗透泵等,使其在某一种药物的持续刺激下形成心肌肥厚。 主要用的药物有去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、去氧肾上腺素(phenylephrine,PE)、异丙肾上腺素(isoprenaline, ISO)、 甲 状 腺 素、 血 管 紧 张 素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)等。

1.1.3 生物法

生物法目前有自发性高血压大鼠模型[10]。 自发性高血压大鼠在出生之后,随着时间变化,血压不断升高,心肌质量在4 周时开始增加,血压在3～4个月时稳定升高,心肌肥厚加重。

1.2 小鼠心肌肥厚模型

上面阐述的大鼠制备方法,在小鼠上亦可获得心肌肥厚,同时,小鼠是目前基因修饰种类最为丰富的物种,在研究基因功能及相关发病机制方面应用最为广泛,通过基因修饰可以获得遗传性心肌肥厚模型。 此外,在感兴趣基因的基础修饰小鼠上给予心肌肥厚刺激,是小鼠心肌肥厚模型未来的主要研究方向。

基因修饰获得心肌肥厚包括:1)肌球蛋白突变模型:2 条重链(MHC)和2 条轻链(MLC)一同构成肌球蛋白,MHC 又有 α 和 β 两种亚型。 小鼠 α-MHC 基因第403 密码子错义突变会致使其左心房心肌肥厚；2)肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC)突变模型:小鼠的心肌肥厚可由MYBPC 的缺失、插入或剪接位点的突变等致使；3)肌钙蛋白突变[18]:小鼠TnT 突变,该突变导致TnT 外显子缺失小鼠表现出较小的左心室,严重的舒张期和较轻的收缩功能障碍。

1.3 大型动物心肌肥厚模型

啮齿类动物与人类的心脏在结构、心率、耗氧量、收缩力、蛋白质表达等方面都存在差异,因此,大型动物心肌肥厚及代偿失代偿模型的建立具有重要研究价值。

大型动物除了上面阐述的DOCA 盐敏感性高血压法、化学法外,其特有的心肌肥厚模型建立方法有:1)二尖瓣返流(mitral regurgitation,MR)致心肌肥厚:常用的实验动物为犬或羊。 该方法采用胸内或开胸手术断裂动物瓣膜上的腱索来破坏二尖瓣,前者借助超声定位,用心肌活检钳将二尖瓣前叶缘上一条腱索夹断；后者需在胸骨正中切口,将心包切除,金属器械插进左心室心尖或切开心房来将腱索破坏,从而造成二尖瓣关闭不全,致使心肌肥厚；2)主动脉束带法[19]:常用的实验动物为猪。该方法是进行手术干预,通过结扎或夹子(主动脉束带)部分阻塞升主动脉或降主动脉,然后突然增加闭塞前压力,通过束带逐渐形成主动脉缩窄以及肺动脉或肾动脉狭窄,从而引起左心室肥厚。

2 心肌肥厚分子机制研究进展

心肌肥厚通常是作为对血流动力学压力或心肌损伤的适应性反应而引发的,即心脏为适应各类刺激而发生的心肌质量增加,体积增大。 在初始的代偿阶段,心室容积轻微增大,肥大的心肌细胞收缩和舒张的时间变长,速度变慢,但仍可保持良好的肌纤维缩短和心室排空能力。 心肌肥厚是很多心脏疾病发展的一个重要阶段,但它的形成机制仍不完全清楚,目前有关的研究都集中在一些通路上。

2.1 有丝分裂蛋白激酶(MAPKs)信号通路

MAPK 信号通路包括以下分支:1)细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERKs):ERK 分支的信号通常在细胞膜上与Ras 激活协同启动。 Ras 与Raf 偶联,之后偶联 MAPK 激酶MEK1 和MEK2,MEK1/2 作为双重特异性激酶起作用,可直接磷酸化ERK1 和ERK2 激酶中的TEY基序；2)c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNKs):MAPK 激酶激酶的激活,如MEKK1,促进双重特异性激酶MKK4 和MKK7 的激活,进而直接磷酸化JNK 蛋白中的 TPY 基序；3)p38 激酶[20]:p38激酶中的TGY 基序可以通过激酶之间的偶联被磷酸化而发挥作用。 在心肌细胞中,上述三个MAPK分支中的每一个都由G 蛋白偶联受体(G proteincoupled receptors,GPCRs)通过神经内分泌因子如血管紧张素Ⅱ、内皮素-1 和儿茶酚胺来调节,此类激活特征表明MAPK 信号介导或调节心脏肥大反应。

2.2 Ca2+介导的信号通路

在细胞内,增多的Ca2+可致使心肌肥厚,这可以作为最基本的信号。 其主要机制有:(1)钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)信号通路[21-23]:CaN 直接与细胞质中活化T 细胞(nuclear factor of activated T cells,NFAT)转录因子的核因子结合并使其去磷酸化,从而使它们易位至细胞核中,介导肥大基因的表达；(2)钙调素依赖性蛋白激酶信号通路:钙调蛋白依赖性激酶II 受Ca2+钙调蛋白复合物和ROS 的调节,交换蛋白被cAMP 激活,直接诱导心脏肥大。

2.3 蛋白激酶信号通路

蛋白激酶信号通路有[24-26]:1)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信号通路:Akt1 短期激活通过协调上调VEGF 的表达诱导生理性肥大,而Akt1 长期激活促进病理性肥大；2)蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)及其介导的信号通路:PKC 在发挥作用时,一方面可以直接移入细胞核调节核基因的表达,另一方面可以在胞浆内通过活化 Raf-1 与MAPK 信号通路偶联。 有研究表明,α-肾上腺素能受体通过Gq-磷脂酶C 途径激活PKC,这是对心脏肥大的有效刺激。

2.4 Janus 激酶(JAK)/信号转导子和转录激活子(STAT)信号通路

心肌表达多种IL-6 家族细胞因子[26-27]。 JAK/STAT 通路可以在IL-6 细胞因子与糖蛋白130 结合之后被激活,进而参与细胞生物过程。 研究证实,激活的JAK-STAT 通路可以致使心肌肥厚,并与心肌梗死、扩张性心肌病等相关。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路

AMPK 是细胞中的节点能量传感器,可以随着营养利用而协调代谢输出的增加。 AMPK 是一种异源三聚体蛋白激酶,由催化性α 亚基、连接α 和γ的β 亚基和结合糖原组成,γ 亚基以相互排斥的方式结合 AMP、ADP 或 ATP。 AMPK 通过构象变化导致其活化[28]。 能量水平下降导致 AMP 激活AMPK,通过刺激脂肪酸氧化,葡萄糖摄取和糖酵解及减少依赖于ATP 的过程来促进转录和蛋白质合成。 因此,AMPK 对心脏动态平衡至关重要,大多数研究表明,长期抑制AMPK 会加剧病理性肥大,导致心力衰竭,而间歇性AMPK 激活可能具有心脏保护作用。

2.6 MicroRNAs(miRNAs)信号通路

MicroRNA(miRNA)的功能是使特定的mRNA转录功能沉默[29]。 单个miRNA 可能具有数十至数百个靶基因,并且有越来越多的证据表明miRNA 在心脏发育、肥厚和衰竭中起作用。

3 心肌肥厚失代偿分子机制研究进展

流行病学的研究表明,心脏正常的心肌肥大随着时间的推移会降低心脏的功能,导致组织学纤维化、Ca2+处理蛋白失调、线粒体功能异常、心肌细胞损伤、舒张功能障碍和纵向收缩功能均恶化,发展为“心肌肥厚失代偿”,并在临床上会导致心力衰竭。 心肌肥厚失代偿的分子机制研究主要集中在经典信号传导通路、细胞的生长与凋亡以及心肌细胞的钙代谢等方面。

3.1 经典信号传导通路

3.1.1 血管紧张素Ⅱ系统及其信号通路

受体1(AT1)和受体2(AT2)是 Ang Ⅱ的受体[30-31],一些通路可在AngⅡ与AT1 结合后活化,而细胞生长的抑制及细胞凋亡均与AT2 有关。

3.1.2 G 蛋白和环磷酸腺苷(cAMP)

研究表明,Gq 通过参与AngⅡ等诱导的信号传递来阻止Akt 磷酸化,则致使心肌细胞凋亡增强,造成心脏的功能失调。 在β 肾上腺能受体激活后,腺苷酸环化酶被Gsα 亚单位激活产生cAMP,可以活化蛋白激酶A(protein kinases A,PKA)。 PKA 可以磷酸化多种与心肌功能有关的蛋白质[32-33]。

3.1.3 生长因子及其信号传导通路

多数生长因子受体是跨膜受体酪氨酸激酶,经过 Ras、Raf、MEK、ERK 途径活化转录因子,调节核内基因的表达。 生长因子 FGFs、IGFs、PDGFs、TGFs[34],均会使得心肌细胞肥大。

3.2 细胞凋亡

细胞凋亡在调节细胞数量和结构重塑中发挥重要作用[35]。 有研究显示,细胞凋亡致使的心肌细胞丢失,会引发心功能失调,发展下去致使心衰,这说明细胞凋亡在心肌肥厚代偿向失代偿发展的过程之中起作用。

3.3 心肌细胞的钙代谢

钙代谢与心肌细胞舒缩联系紧密[36]。 心肌钙的钙释放是钙离子通过细胞表面的L-型钙离子通道(LCC) 内流,激活肌质网上的雷诺定受体(ryanodine receptor,RyR),促进肌质网内的钙离子流入胞质,从而引起胞内钙离子浓度瞬时增加,其控制着心肌收缩的力量,研究表明在心脏肥大及失代偿进程中心肌钙释放失调发挥了重要作用。

4 结语

多年来,国内外文献报道了很多种心肌肥厚动物模型的建立方法,即压力超负荷法、容量负荷法、药物诱导法、基因修饰法等。 心肌肥厚动物模型的成功率、和人的相似程度都在逐渐提高,这对心肌肥厚的研究具有推动作用。

心肌肥厚可致使血压降低、心肌细胞肥大和凋亡,心室顺应性下降以及射血功能受损,从而使得心脏功能恶化。 总而言之,心肌肥厚已经是心血管疾病领域内越来越重要的因素,所以探索其机制尤为重要。 很多研究证明其过程与一些信号通路有关,这些信号通路交织在一起,信号通路效应因子之间相互作用,形成一个复杂的网络。 虽然在分子机制方面已经取得很大进展,但许多问题仍未完全清楚,需要进一步探究。