核磁共振技术在蜂蜜植物糖浆掺假检测应用的研究进展

吴 迪 李丽君 王丹丹 谢雨思

（南京财经大学 江苏南京 210023）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或者分泌物经自身含有的特殊物质酿造而成的甜味物质，是天然的甜味剂[1]。同时，蜂蜜中含有糖类、水分、矿物质、维生素、蛋白质、氨基酸乙酰胆碱、生物类黄酮、酚酸等多种营养成分，具有一定的防腐功能和良好的抗衰老特性。由于消费市场对天然保健品的热捧，蜂蜜及蜂蜜制品愈加受消费者的青睐。

目前，我国蜂蜜年产量稳定在 4×105～4.5×105t，占全球产量的25%，消费量高达7×105t，市场需求旺盛，是名副其实的蜂蜜生产和消费大国[2]。巨大的消费市场蕴含着巨大的利益，受利益驱使，大量假劣蜂蜜出现，使我国蜂蜜在国际贸易市场被贴上“低质低价”的标签，也使广大消费者的合法权益受到了侵害。糖浆掺假、蜂蜜浓缩、蜜种和溯源地以次充好等现象是影响我国成为“蜂蜜生产强国”的重要原因之一。原国家食品安全监督部门2014—2018年对蜂蜜产品的抽检结果显示，蜂蜜的平均合格率约为98.2%。其中，果糖和葡萄糖不合格数量占不合格样品总量的17.1%，糖浆掺假问题较为严重[3]。此外，采用不同品种和产地的低价蜜与高价蜜进行互掺造假的方式也非常普遍。

蜂蜜掺假鉴别技术受植物糖浆与蜂蜜成分相近、蜂蜜种类繁杂、产地多样和掺假工艺不断变化等因素影响，市场监管部门的行政执法也因此受到了严重制约。

目前，我国蜂蜜产品的现行标准更侧重于理化指标和安全指标，而蜂蜜中糖浆掺假的鉴别常用方法仅有GH/T 18796—2012《蜂蜜》[4]中的碳同位素比率法和GB/T 18932.2—2002《蜂蜜中高果糖淀粉糖浆测定方法 薄层色谱法》[5]。其中，碳同位素法对于掺入C-3类糖浆无效，薄层色谱法受检验员主观性影响较大，容易造成结果的误判。同样，针对蜂蜜中蜜种和溯源地掺假鉴别的常用分析方法主要有感官鉴别和花粉分析，其检测结果同样受测试者的主观性影响。除此之外，文献中有光谱、色谱、质谱等方法及其联用技术[6]、显示扫描量热法[7]和淀粉酶值（DN）评定法[8]等多种检测方法用于蜂蜜掺假鉴别，这些方法有其各自的优势。其中，作为光谱检测技术的一种，核磁共振技术（NMR）具有操作简单、分析结果精确度高、重复性好、无损、快速等优点，在食品质量安全检测领域被广泛关注并逐渐在食品掺假检测中发挥作用。

2 NMR简介及仪器介绍

核磁共振现象源于核自旋和磁场的相互作用，是指磁矩不为零的原子核在外加磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一特定频率射频辐射的物理过程。NMR根据用途可以分为图像采集技术和谱图采集技术；根据仪器磁场强度可以分为低场核磁和高场核磁；根据所测样品的相态可以分为固体核磁和液体核磁。不同种类的NMR（谱仪）可获得的样品信息也各有侧重，其中，高场核磁（液体）共振和低场核磁共振（时域谱）技术及相关仪器在蜂蜜掺假检测中应用较广。

目前，常见的商用高场核磁共振波谱仪一般为脉冲核磁共振谱仪，包含磁体、机柜、前置放大器、探头和计算机等部分。磁体主要为超导磁体，场强在0.3×109～1.2×109Hz（对1H 核频率而言）。高场核磁利用宽频带强脉冲对样品进行持续辐照，接受照射后的样品磁核激发，跃迁到高能态（激发态），当照射停止后，处于激发态的磁核发生弛豫，回到低能态并最终达到玻尔兹曼分布的热平衡状态。此过程体系会发射自由衰减信号（FID），接收器在采集并记录到样品的FID信息之后，经过傅立叶变换和多次累加，得到频域谱图数据。结合对样品中所含化学屏蔽、耦合和四极等相互作用的解析，获得样品精细分子结构的信息。目前，食品科学中利用高场NMR可以对食品中的合成色素[9]进行检测，对食品复杂基质中的农药残留[10]和兽药残留及其代谢过程[11]进行有效监控，同时，该技术在食品天然产物中的多糖结构解析[12]和蛋白质三维结构解析和动力学研究[13]等领域发挥着重要作用。

商用低场核磁共振谱仪的磁体通常为永磁体，场强在 2×101～2×108Hz（对1H 核频率而言）。 与高场核磁不同，低场NMR主要用于测试样品分子间的动力学信息，所得谱图为时域谱。低场核磁共振利用不同物质、相态中原子核（主要为1H）自旋的弛豫时间差异对样品进行定性、定量检测，可测定样品的玻璃化转变温度、交联密度、孔径分布和孔隙度等参数，广泛应用于食品工业、石油化工、医药、纺织等行业。目前，低场NMR可以对不同掺假形式（掺水、食盐、尿素、豆浆、复原乳以及合成牛奶等）的牛乳进行快速准确鉴别，也可用于芝麻油、豆油、五常稻花香米、酒类等食品掺假行为的快速检测[14-17]。

3 高场NMR在蜂蜜掺假鉴别中的应用

作为最常用的理化表征方法之一，高场NMR主要利用化学位移的不同确定目标核（通常为1H或13C）所处的不同化学环境，从而定性、定量分析样品中所含基团的种类和比例。蜂蜜组成物质相对复杂，除主要成分糖类（质量占比65%以上）外，还有约20%的水分和少量的蛋白质、酶及游离氨基酸、多酚黄酮类物质及矿物元素和微量元素。不法分子若利用与其主要成分糖类（包含果糖和葡萄糖）相类似的果葡糖浆进行掺假，极易达到国家标准中对糖类指标的要求，直接规避了薄层色谱法的检测。此外，若所加糖浆为C-3循环植物糖浆，更可使同位素质谱法无法对其进行有效甄别[18]。随着不法商贩制假造假方法的不断变化，灵敏度相对较低的谱学方法受到了极大限制，在此情况下，针对蜂蜜中小分子化合物进行检测的高场NMR显现出其在蜂蜜掺假鉴别中的明显优势。

蜂蜜的H-1核磁共振指纹图谱通常可以分为3部分，即脂肪区（化学位移 0～3×10-6）、糖类化合物区（化学位移 3×10-6～6×10-6）和芳香区（化学位移 6×10-6～10×10-6）。利用化学位移、峰型和耦合常数等核磁谱学信息可以对各个区域的核磁信号峰进行归属，进而有效鉴别蜂蜜中所含的小分子化合物。但因为蜂蜜体系过于复杂，部分成分的信号峰会出现重叠现象，使谱图信号指认和定量分析受到一定限制，目前，大多研究利用多元统计分析的化学计量学方法对核磁谱图中的提取信息进行分析[19]。

国内外的研究者通常利用高场NMR结合化学计量学方法鉴别蜂蜜中的糖浆掺假。

Bertelli等[20]采用1H谱一维NMR和1H-13C二维NMR结合多变量统计分析方法对不同植源的63种真蜂蜜和7种不同糖浆3个浓度梯度随机掺假的63种掺假蜂蜜进行了表征。结果表明，1H谱的一维实验结合留一法交叉验证的模型可以给出交叉验证分类正确率为95.2%的预测能力，明显高于1H-13C二维实验的90.5%。考虑到二者的实验时间（1H谱一维实验99秒，1H-13C二维实验4362秒）和难易程度，显然1H谱的一维实验在蜂蜜糖浆掺假鉴别中更具优势。同时，作者指出NMR具有将谱图中所有反常信号进行独立归属的优势，在建立足够完善的核磁谱图数据库之后，利用不同类型和植源糖浆的分子指纹图谱可以对蜂蜜的糖浆掺假行为进行高精度的鉴定。

Spiteri等[21]利用1H谱高场NMR结合量化程序和统计模型创建了一种用于蜂蜜的掺假鉴定分析方法，其核心在于对是否存在外加糖和外加糖的加热或者发酵效果进行定性评价。该方法已经成功应用于1 400个商业样品，其对照样品涵盖了世界范围内常见植源和溯源地的超800种蜂蜜。为研究建立的模型是否可以用于真实的蜂蜜掺假鉴别，作者向对照蜂蜜中添加了不同浓度梯次的多种糖浆（甜菜全转化糖浆、葡萄糖浆以及菊粉提取的高果糖糖浆）。识别外加糖浆相对简单的方法为观察糖浆标记物，或者选择观察细小组分的稀释效应。

文中结果表明，当掺杂物中出现标记峰时，该方法的最小检出限约为10%；完全依据稀释效应时检测阈值明显更高，但20%的添加仍可被检出。文中特别指出，稀释效应是检测没有标记峰的C-3植物糖浆掺假的唯一方法，所以优化该标准对实现所有类型的蜂蜜鉴别至关重要。有效结合高分辨质谱和核磁共振波谱技术对糖浆标记物进行判别为利用NMR鉴别C-3植物糖浆掺假提供了一个新的研究思路[22]。

前文刘芸等利用1H NMR研究了82个样本（包含61个多蜜种、多产地和多种加工工艺的蜂蜜样品和基于甜菜、大米、木薯、小麦和果葡糖浆及其混合糖浆的糖浆样品）的核磁指纹图谱变化情况，并对从核磁信号中提取的信息进行了多元统计分析（包含无监督的主成分分析以及有监督的偏最小二乘和正交偏最小二乘判别分析），结果表明，基于正交偏最小二乘判别分析建立的模型可以有效鉴别蜂蜜掺假，鉴别能力为90.5%，对未知样品的预测能力为75.5%、识别率为89.7%。利用该方法可以简单快速的实现对未知蜂蜜的掺假鉴别。

陈雷等[23]也利用1H NMR结合正交偏最小二乘法对由303个油菜蜂蜜样品和18种市售果葡糖浆按5种质量配比掺杂形成的180个样品进行研究，其建立的数学模型可以有效区分蜂蜜样品和掺假样品，判别正确率达98%以上。

4 低场NMR在蜂蜜中植物糖浆掺假鉴别中的应用

蜂蜜是一种非常复杂的多组分体系。利用低场NMR实现对蜂蜜中植物糖浆掺假鉴别的理论基础在于蜂蜜基质中不同组分其水分含量和相态有明显差异，这些差异会导致样品中的质子横向弛豫时间T2随之变化，而这些由不同结构中存在可测质子的特征弛豫时间的线型组合，组成了样品的低场核磁共振弛豫曲线。通常，样品的横向弛豫时间T2可通过名为 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）的多窗口自旋回波脉冲序列测出，其本质是检测蜂蜜中各组分水的浓度和相态变化[24]。在食品科学研究领域，通常可根据T2弛豫时间的多指数特性将食品中的水分为2种（或3种），即自由水、结合水（或半自由水）。Ribeiro等[25]利用低场NMR对纯天然蜂蜜中不同质量浓度（10%、25%、50%、75%、100%）掺杂高果糖浆的样品进行表征，结合常规的蜂蜜理化特性指标（水分含量、pH、色差、灰分和水活度）对蜂蜜的糖浆掺假行为进行研究。通过比较样品的连续分布曲线发现，不同掺杂比例样品的水活度明显不同，这可能是由于高果糖浆的水活度。通过对所有样品的T2驰豫曲线多指数拟合结果进行分析，发现双指数模型可满足曲线拟合的需求，该结果意味着体系中存在2种主要的水分浓度，对应2种横向弛豫时间（T21和T22）。而通过对不同掺杂比例的蜂蜜-糖浆样品的双指数弛豫反演曲线进行分析，发现2种水分分布中弛豫较快的T21弛豫时间分布在1.26～1.60 ms，而弛豫较慢的T22，其弛豫时间分布在3.33～7.38 ms，由掺杂高果糖浆的比例决定。纯蜂蜜样品的T21数值更大（1.60 ms），表明纯蜂蜜样品中的水的移动性更低，低场NMR可以利用水的移动性差异，定性、定量地对蜂蜜中的糖浆掺假行为进行快速检测。同时，作者也证明该技术可用于蜂蜜的品种和植源的快速检测。

5 结语

综上所述，利用高场NMR对蜂蜜中植物糖浆掺假行为进行定性、定量检测具有样品前处理简单，仅须称取10～200 mg样品溶于氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）或重水（D2O）中；检测时间短，通常1H的一维谱图采样时间可低于5 min；定量准确；重复性好；灵敏度高等优势。对小分子化合物结构信息的快速获取和实时监控在一定程度上满足市场监管部门的抽检要求，更适合多批次大量样品的实验室检测。然而，其高昂的设备价格和日常维护成本以及烦琐的谱图分析过程极大程度上制约了其在市场监督执法领域的应用。低场NMR与之相比，设备成本相对较低，对测试环境要求较低，更适合市场监管现场执法和快速筛查，但仍需广大科研工作者进行更加深入和广泛的研究。结合化学计量法对上述2种NMR采集数据进行多元分析可以大幅提升其对蜂蜜样品中植物糖浆掺假检测的精确度和实用性，随着蜂蜜数据库的不断扩大和完善，2种技术未来可在市场监管中发挥更巨大的作用。