牛病毒性腹泻病毒诊断方法与防治措施

帕力达·阿奴尔别克

（新疆伊犁州尼勒克县畜牧兽医工作站 835700）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，与同属的猪瘟病毒、羊边界病毒在血清学上存在交叉反应，BVDV 具有两种基因型，根据是否存在细胞病变可以分为细胞病变型和非细胞病变型，细胞病变型的致病性较强。BVDV 感染会导致母牛繁殖障碍，给胎牛会造成持续性感染，导致胎牛畸形或死亡，BVDV 除了在临床感染牛、羊、鹿、骆驼、猪等易感动物外，还可以造成疫苗等生物制品的污染，由于疫苗在生产过程中不可避免的需要使用牛血清等原辅料，如果牛血清等原辅料中存在BVDV，将造成生物安全的隐患，故加强BVDV 诊断与防治研究意义非常重大。为了准确诊断BVDV，除了根据临床发热、腹泻等临床症状进行临床诊断外，主要以实验室诊断为主，现将BVDV 的主要实验室诊断方法和防治措施介绍如下。

1 RT-PCR 检测方法

RT-PCR 检测方法是当前动物疫病诊断最常用的分子生物学检测方法，由于可以检测到不同致病源的特异性基因片段，故根据BVDV 的保守序列设计通用检测引物以及根据不同基因型的差异序列设计分型检测引物，即可实现BVDV 的鉴定和分型研究。李新培等[1]根据GenBank 中公布的BVDV 高度保守的5′UTR 序列分别设计鉴定引物及分型引物，建立了BVDV 的鉴定RT-PCR 检测方法及分型RT-PCR 检测方法，鉴定引物对BVDV-1 型和BVDV-2 型均可以扩增出大小为288bp 的特异性片段，分型引物对BVDV-1 型和BVDV-2 型可以分别扩增出大小为316bp 和110bp 的特异性片段，该检测方法可以用于BVDV 的流行病学调查和临床病料检测，具有广阔的应用前景。

2 荧光定量PCR 检测方法

荧光定量PCR 检测方法是在常规PCR 方法中融汇光谱技术发展起来的一种敏感性更高的核酸定量检测技术，刘存等[2]建立了BVDVSYBR Green 荧光定量PCR 检测方法，该方法有很好的敏感性和特异性，敏感性达到10 拷贝的最低检测下限，与牛副流感病毒3 型、牛传染性鼻气管炎病毒不存在交叉反应，唯一不足的是不能实现与猪瘟病毒的鉴别诊断。王艳杰等[3]建立了BVDV-1 和BVDV-2 双重TaqMan 荧光定量PCR鉴别检测方法，该方法是根据牛病毒性腹泻病毒5′UTR 区设计鉴别检测引物和探针，与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒等没有交叉反应，该方法对BVDV-1 的最低检测下限为10 拷贝/μL，对BVDV-2 的最低检测下限为100 拷贝/μL，可以用于BVDV 的临床诊断及分型鉴别检测。

3 LAMP 检测方法

LAMP 检测方法为一种环介导等温扩增技术，是一种新型的核酸等温扩增技术，具有操作简单和现场应用方便等优点，可以用于疾病的快速临床诊断。李家伟等[4]针对BVDV 5′UTR基因序列设计4 条特异性LAMP 检测引物，通过优化反应时间和反应温度，建立了BVDV RT-LAMP 快速检测方法，该方法在63℃等温条件下50min 即可完成反应，最低可检测到10-6倍稀释的BVDV 病毒液，比常规RT-PCR 检测方法的灵敏度至少高100 倍，与其他病毒没有交叉反应，具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优势，可以用于BVDV 的现场诊断和监测。

4 ELISA 检测方法

ELISA 方法因具有操作简单、特异性强、灵敏度高、高通量、易于大规模检测等优点，在动物疫病临床诊断和流行病学调查中得到了广泛应用。胡俊英等[5]利用制备的BVDV 单克隆抗体与多克隆抗体建立了BVDV 抗原的双抗体夹心ELISA 方法，该方法具有较高的特异性和敏感性，该方法可检测到160倍稀释的BVDV 阳性粪便样品，与牛肠道病毒、口蹄疫病毒、牛细小病毒不发生交叉反应，该方法与常规RT-PCR 方法的符合率达到100%，双抗体夹心ELISA 方法非常适合于大规模样品中BVDV 感染的流行病学调查，为BVDV 感染的诊断、检疫、净化及防治提供了有效的技术手段。

5 防控措施

BVDV 没有特效治疗药物，预防本病最有效的方法是疫苗免疫接种，对6～10 月龄的犊牛接种灭活疫苗，牛场要坚持自繁自养，不从疫区引进犊牛，新引进的犊牛可以通过采血监测血清中和抗体，BVDV 抗体阴性方可以混合饲养[6]。由于公牛的精液也可以传播BVDV，所以注意在配种时也要加强公牛的病毒检测，确保配种所用的种公牛没有感染病史，排除带有牛病毒性腹泻病毒及隐性感染的牛，减少安全隐患。总之，BVDV 对养牛业危害巨大，是牛群高度易感的重要病毒性传染病，养殖场要加强疫苗免疫接种和生物安全防控，发现带毒牛患病牛要及时隔离治疗或淘汰，加强饲养场的环境消毒，保证饲料和饮水清洁，定期清理粪便，加强牛舍通风换气，做好防寒和保暖措施，引种时严格隔离检疫，只有做到BVDV 的积极防控才能降低发病风险，促进养牛业健康发展。

6 结语

BVDV 是一种接触传染性疾病，呈全世界分布，严重危害畜牧业的健康发展，加强BVDV 实验室诊断技术和防控措施对BVDV 的有效控制与净化至关重要。当前，在BVDV 诸多实验室诊断方法中，RT-PCR 方法操作简单、检测快速、只需要简单的仪器设备，但其检测灵敏度较荧光定量PCR 方法低。荧光定量PCR 方法的敏感性比常规RT-PCR 方法高，但该方法对试验人员技术水平、仪器设备要求均较高。LAMP 检测方法无需仪器设备，操作简单，该方法对引物设计的要求较高。ELISA方法高通量、操作简单、适合大批量样品的流行病学调查。在BVDV 的防控中，应采取以预防为主的综合防控措施，即加强疫苗免疫接种与生物安全、加强日常的饲养管理措施，尽量避免BVDV 的感染，对于已经感染BVDV 的牛群应逐步淘汰、净化。