纳米颗粒在兽用疫苗中的应用

程志萍

（四川省水产学校 四川成都 611730）

1 前言

当今各类传染性疾病严重威胁着人类和动物的健康，在长期的研究中发现，疫苗免疫是预防疾病最行之有效的措施。18 世纪后期，英国医生琴纳应用牛痘预防天花，发明了第一代疫苗：灭活疫苗和减毒疫苗。随着基因工程技术和分子生物学的不断发展，出现了如亚单位疫苗、多肽疫苗和脱氧核糖核酸（DNA）疫苗的第二、三代疫苗。然而，这些疫苗存在免疫原性弱、免疫剂量大、免疫持久性差及易降解等缺点。纳米颗粒具有靶向递送的作用，可维持抗原稳定性，增强机体先天免疫、体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，得到了疫苗研发者的青睐。本文综述了新型纳米佐剂的性质、作用特点及其在兽用疫苗中的应用。

2 纳米颗粒特性

2.1 纳米材料

纳米颗粒（Nanoparticles，NP）是指粒径为纳米级（10-9m）的固体胶体颗粒。纳米颗粒可以由金属、非金属、合成聚合物或天然聚合物等多种类型材料形成。纳米材料具有的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应，使其具有了特殊性能。

2.2 纳米粒子的性质

纳米颗粒可通过沉淀法、溶胶-凝胶法、单乳液溶剂蒸发法、乳化溶剂扩散法、聚电解质复合物或自组装聚电解质等方法制备[1]。抗原分子可以与纳米载体表面共轭、包封或表面吸附。在制备过程中可通过改变纳米颗粒物理化学性质，如大小、形状、电荷、表面积和疏水性等性质来对纳米材料进行工程改造，以增强疫苗的免疫效果。

2.2.1 纳米颗粒对细胞吸收的影响

粒径是影响免疫系统摄取NP 的关键因素之一，可以通过细胞吞噬作用和胞饮作用内吞，巨噬细胞和树突状细胞（Dendritic Cells，DC）可吞噬大于500 nm的NP，网格蛋白摄取小于150 nm 的NP，小凹蛋白介导的胞饮作用摄取 50～80 nm 的 NP[2]。NP 除了通过内吞机制侵入细胞外，还可以直接穿过细胞膜进入细胞[3]。20～50 nm 的颗粒适合通过淋巴管运输到达淋巴结，在淋巴结中被抗原提呈细胞（Antigen Presenting Cell，APC）内化，500～2 000 nm 的大颗粒需要通过 APC将细胞转运到淋巴结[4]。

2.2.2 纳米颗粒粒径对免疫应答类型的影响

不同大小的纳米颗粒载体结合的抗原会影响淋巴结内转运和特异性细胞相互作用。Stano 等[5]发现将NP 的大小从30nm 增加到200nm，卵清蛋白（OVA）可以更有效地传递到MHC I 类和MHC II 类演示路径中。使用 200 nm NP 的鼻黏膜免疫增加了肺部T 辅助（CD4+T）细胞反应以及全身和黏膜反应。50～100 nm大小的纳米颗粒比5～15 nm 纳米粒子产生的特异性抗体高5 倍[6]。

2.2.3 纳米颗粒大小及给药途径对分布的影响

NP 的生物分布取决于给药途径和大小。纳米颗粒经口服、鼻和眼输送可提供黏膜保护性免疫反应，纳米粒子能被黏膜相关淋巴组织中的M 细胞（MALT）吸收，从而介导免疫反应[7]。皮内注射后，间隙流将超小纳米颗粒（25 nm）高效地转运到淋巴毛细血管及其引流淋巴结中，靶向50%的淋巴结驻留树突状细胞，而100 nm 纳米颗粒的效率仅为10%[8]。

2.2.4 纳米颗粒形状对吸收分布及免疫类型的影响

有研究报道了纳米粒子的形状依赖分布，短杆二氧化硅纳米粒子（MSN）主要分布在肝脏，长杆MSN分布在脾脏[9]。MSN 经聚乙二醇（PEG）修饰后在肺中的含量更高。MSN 主要通过尿液和粪便排出，MSN的清除率主要取决于颗粒形状，短杆MSN的清除率比长杆更快。棒状金纳米颗粒（AuNPs）比球形AuNPs或立方AuNPs 更易被巨噬细胞和骨髓源性树突状细胞（BMDCs）摄取。小的球形颗粒（直径193 nm）产生偏向Th1 的反应，而棒状颗粒（长度1 530 nm）产生偏于 Th2 的反应[10]。

2.2.5 纳米颗粒表面性质对细胞吸收的影响

NP 表面性质如电荷和疏水性会影响其吸收，细胞膜带负电，因此阳离子颗粒更易被APC 吸收，通过DC 到淋巴结。细胞摄取速率和数量均与表面电荷呈正相关，带正电荷的NP 被内化后可在核周定位，而带负电荷和中性的NP 则倾向于与溶酶体共定位[11]。具有高表面电荷和大粒径的NP 被更易被巨噬细胞吞噬，带轻微负电荷且粒径为150 nm 的NP倾向于更有效地积累在肿瘤中[12]。带正电荷的NP 经肺给药后引起强烈的黏膜和全身抗体反应，而带负电荷的NP 则不能[13]。疏水性聚合物颗粒的免疫反应优于亲水性聚合物[14]。

2.2.6 纳米颗粒性质对抗原释放速率的影响

纳米颗粒的抗原的释放取决于多种因素，如大小、纳米聚合物组成、基质的孔隙率、抗原载量或与纳米颗粒的结合方式等。如抗原被包裹，抗原的释放取决于纳米粒的降解，侵蚀或溶解，只有在纳米载体部分或完全解离后才缓慢释放抗原，从而导致较低的释放速率。如果抗原吸附在纳米粒表面，则取决于纳米粒与抗原之间的相互作用，吸附可能导致抗原大量突释；且纳米粒越小，表面积相对越大，表面附近的抗原比例就越大，抗原释放的速度就越快，可能导致免疫反应不足。

3 纳米颗粒在兽用疫苗中的应用

3.1 病毒样颗粒佐剂

病毒样颗粒（Virus-Like Particles，VLPs）是病毒结构蛋白构建的，缺乏传染性核酸而具有非感染性，通过生物相容性衣壳蛋白的自组装形成。VLP 模仿病毒体，可以有效诱导先天性和适应性免疫反应[15]。

口蹄疫病毒（FMDV）3A 蛋白的T 抗原决定簇嵌合于兔出血症病毒（RHDV）的 VLP（RHDV-3A-VLP），在体外可激活未成熟的猪小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）。经鼻内或肌内接种后可诱导特异性IgG和IgA 抗体，如肌内接种加上MontanideTMISA 206佐剂后，其抗体水平更高，明显增加分泌IFN-γ 的细胞数量和针对3A 表位和RHDV-VLP 的淋巴增生[16]。表达 FMDV 衣壳蛋白（VP0，VP1 和 VP3）的 FMDVVLP，肌注豚鼠，猪和牛，刺激了机体FMDV 特异性抗体应答，中和抗体应答，T 细胞增殖应答和IFN-γ的分泌[17]。重组 FMDV 衣壳蛋白VP1 组装的 VLP，也诱导了较高水平的FMDV 特异性体液反应和T 细胞增殖[18]，FMDV-VLP 还可与二氧化硅纳米粒子一起免疫，具有免疫增强的作用[19]。

大肠杆菌表达的重组Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）Cap 蛋白自组装成均质圆形VLP，免疫3 周龄仔猪，可保护对 PCV2 强度的攻击[20]。Li 等[21]将生长抑素（SS）基因融合到PCV2，构建了重组杆状病毒（rAc-Cap-SS），接种动物后，可诱导产生针对 PCV2 和 SS 特异性抗体，相对日增重高于其他对照组。Zhang 等[22]构建的重组杆状病毒Ac-Cap-GM-CSF，表达蛋白后自组装成直径17～25 nm 的VLP，免疫猪后，能提高PCV2 特异性抗体和中和抗体水平。

有报道用杆状病毒表达系统病毒表面蛋白GP5-GP4-GP3-GP2a-M 或 GP5-M 产生了 PRRS 病毒样颗粒（PRRS-VLP），然后将 PRRS-VLP 包裹在 PLGA纳米颗粒中，与强效佐剂鼻内给药。结果表明，PRRS-VLPs 引起记忆缺失的免疫反应，接种疫苗和病毒攻击的动物中IgG 和IFN-γ 产生增强，但在攻击前阶段却没有。且在接种PRRS-VLP 的动物中，肺病毒滴度降低了 2 个对数[23]。另有报道，用 PBS、PRRSV VLP 或 PRRSV VLP 加 2’，3’-cGAMP 佐剂鼻内免疫动物，强度攻击动物，所有动物都检测到PRRSV N 蛋白特异性抗体，但接种组和对照组之间未见显著差异。且在VLP 和VLP 加上佐剂组中观察到明显更高的病毒血症[24]。由此看来，基于 VLP 的PRRSV 疫苗还需进一步研究评估。

另有报道，猪细小病毒PPV-VLP 疫苗，与矿物质油包水佐剂共免疫母猪，产生了高滴度血清抗体。当用强毒株攻击胎儿，能够取得完全保护[25]。流感病毒 H1N1 的 HA，NA 和 M1 蛋白的相关 VLP，肌注猪后，能诱导较强的血清IgG，黏膜IgA 和病毒中和抗体反应，且抑制了上下呼吸道的病毒，减少了肺炎病变[26]。猪脑心肌炎病毒（EMCV）VLP 疫苗免疫后，产生了高水平的中和抗体，且注射部位无严重反应[27]。

3.2 PLGA 纳米佐剂

聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly（Lactic-co-Glycolic Acid），PLGA]是乳酸和羟基乙酸的聚合物，可以用不同比例的乳酸和羟基乙酸聚合成各种分子量和端基类型（酯封端或羧酸封端）。PLGA 由于酯键断裂而降解，最终水解成原始的单体乳酸和羟基乙酸，它们是各种代谢途径的副产物，没有明显的毒性。分子量低、亲水性高和结晶度低的PLGA 分子降解得更快。PLGA 纳米颗粒可通过模仿入侵病原体的大小和形状来增加摄取和交叉呈递。有研究将PLGA 纳米颗粒封装蛋白质抗原，并与激动剂TLR3 和TLR7 配体一起免疫，可有效地靶向DC 并被DC 内吞，促进细胞免疫和体液免疫[28]。

PLGA 纳米颗粒封装的PRRSV 灭活疫苗（NPKAg），经鼻免疫后，猪肺匀浆和血清具有更高的IFN-γ 水平和更低的TGF-β 水平，激发了先天免疫和适应性免疫。当 NP-KAg 与结核分枝杆菌全细胞裂解液一起经鼻免疫后，可提高IgA、IgG1 和IgG2抗体水平，平衡 Th1-Th2 反应，IFN-γ 和淋巴细胞亚群的频率增加[29，30]，引起了广泛的交叉保护性免疫应答，显示出这种创新的疫苗接种策略可防止猪PRRS 爆发。控制食用动物和人类中其他呼吸道疾病的类似方法看来是可行的。猪流行性腹泻病毒（PEDV）灭活抗原（KAg）的 PLGA 纳米颗粒（PLGA-KAg），免疫的妊娠母猪后，PEDV 特异性IgG 和IgA 抗体滴度显著提高。配合MontanideTMISA 201 VG佐剂使用后，诱导了更好的淋巴细胞增殖反应和IFN-γ 水平，且对仔猪有保护作用[31]。猪流感病毒（SwIV）H1N2 抗原（KAg）的 PLGA 纳米颗粒（PLGA-KAg），经鼻免疫后，增加了抗原特异性淋巴细胞增殖，增强了外周血单核细胞（PBMC）中T 辅助/记忆和CTL的频率，并降低了猪气道中挑战的异源病毒载量，但抗体水平未见提高[32，33]。

3.3 壳聚糖纳米佐剂

壳聚糖（Chitosan，CS）是由甲壳素（例如，蟹，虾和小龙虾）的主要成分甲壳质经脱乙酰作用而得到，化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，脱乙酰基程度可影响其分子量、电荷密度和溶解度等，使其具有独特的理化性能和生物学功能。壳聚糖可以激活树突状细胞，诱导DC 成熟和分泌细胞因子。

壳聚糖纳米颗粒（CNP）包埋的猪IL-2 和IL-4/IL-6 作为PCV-2 疫苗佐剂，可促进猪特异性免疫应答[34]。壳聚糖/海藻酸钠纳米颗粒包封的BV（CH/ALBV），作为猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）疫苗佐剂，经鼻免疫，可以有效诱导Th1 相关的免疫反应，激活CD4+T 淋巴细胞，增加细胞因子（IFN-γ 和 IL-12）和转录因子（STAT4 和 T-bet），还刺激 IFN-γ 分泌细胞家族[35]。将灭活的猪甲型流感 H1N2 抗原（KAg）封装在CNP 中，经喷雾免疫，显示增强细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应[36]。CNP 很有潜力作为黏膜疫苗佐剂。

3.4 其他纳米佐剂

有研究表明，氢氧化铝NP 用做高致病性禽流感病毒HPAIV（H5N1）的免疫佐剂，提高了其抗体水平，降低了佐剂的副作用[37]。脂质体NP 封装流感病毒肽段后，与佐剂共免疫，增强了黏膜免疫反应，并诱导特异性T 辅助/记忆细胞以及IFN-γ 应答，减轻了临床症状[38]。磷酸钙纳米颗粒偶联新城疫（NDV）疫苗引起更强和更长的免疫反应，且鸡血清钙和磷水平未见升高[39]。金纳米颗粒与 CpG[40]、壳聚糖[41]佐剂联合使用，与流感、破伤风类毒素经鼻或口服方式给药，激活了局部免疫反应和全身免疫反应。

4 结论

纳米颗粒应用于疫苗，具有载体兼佐剂的作用，其促进免疫原性的机制主要为：促进DC 的吸收，抗原缓释，靶向呈递，交叉呈递，增强抗原的稳定性等。可以通过基因工程技术构建多价苗和多联苗，还可将多种纳米颗粒融合使用，多种途径进行免疫，以激发更全面的免疫反应。纳米颗粒大小、形状、表面电荷、疏水性、孔隙率和结晶性等特性对纳米佐剂的内吞、释放及免疫应答的调节等方面有较大的影响。在应用中，如何控制纳米粒的大小、形状、均一性，减小体内环境对纳米粒的影响，以何种方式合成和化学修饰纳米材料，减小毒性，以合理的途径进行代谢，并减小对环境的污染等问题，还需要人们进行大量的研究，以开发出更加安全、有效、实用的新型纳米颗粒，为疫苗研发提供潜能。