杀虫剂发现——作物保护工业新时代和天然产品的影响

叶 萱 编译

(中国农药工业协会，北京 100723)

数个世纪以来开发害虫防治新工具一直是作物保护行业的重要需求，在今天全球人口不断增加和传播疾病昆虫的威胁下更是如此。尽管有许多防治害虫的技术，如生物防治、转基因植物、抗性寄主植物、栽培措施和不断增加的生物农药，但在许多情况下，杀虫剂仍然是防治害虫的主要手段。人类早期用天然产品（NP），如烟碱和除虫菊（表1），硫磺和砷化物等无机物防治害虫。在20世纪40年代和50年代期间，引入了合成有机杀虫剂，如滴滴涕（DDT）、有机磷类（OPs）、环双烯类和N-甲基氨基甲酸酯类杀虫剂（表1），害虫防治发生了重大变化。20世纪40年代晚期到60年代为“杀虫剂发现的黄金时期”，高效、可靠和负担得起的害虫防治物质已普遍应用。 然而， 在同一时期内，杀虫剂的抗药性增加（图1）。抗药性的增加以及人们对杀虫剂对哺乳动物和环境毒理学的日益关注，推动了综合害物管理（IPM）的引入，以及在随后几十年中对更多选择性杀虫剂的开发，这导致杀虫剂类别大量扩增（表1）。

在过去50年中，作物保护行业成功开发了具有许多特性的杀虫剂，包括选择性高和用量少的杀虫剂。在过去几十年中开发的杀虫剂的环境友好性增加了，但在日益严格的监管要求以及公众对更环保产品的需求下，进一步降低对环境的影响将继续是开发新产品的目标。同时昆虫对杀虫剂的抗性案例数量持续上升，抗药性问题是另一驱动杀虫剂开发的主要因素。因此，需要新作用机制和对环境影响进一步降低的新杀虫剂来管理杀虫剂抗性（IRM），给种植者提供满足或超越当前和未来的环境标准要求的选择。

1 作物保护工业进入了杀虫剂发现的新时代

由于开发新杀虫剂的时间增加，开发和登记费用增加，所以新杀虫剂的发现和商业化费用越来越高，平均每个产品为3亿美元。这些因素已驱动作物保护工业发生变化，如公司合并（图2）。在合成农药发现的前几十年中，全球有65家公司参与了新作物保护化合物发现的研究与开发工作（R＆D）。欧洲开发研究公司数量在20世纪50年代达到高峰，而美国的开发研究公司数量大约在20世纪40年代达到峰值（图2），日本此峰值发生在20年后。自这些行业发展达到高峰以来，作物保护化学行业发生了演变和整合，以达到一定经济规模，并具备成功发现新化合物的必要条件。作物保护工业的如此发展导致相关研究开发公司数量减少，目前在欧盟、日本和美国进行新的作物保护化合物研究开发的公司减少到22个。在许多情况下，剩下的公司比其前身规模要大得多，资源也更多（Sparks，2013年；Sparks和Lorsbach，2017b），创新能力更强，并参与众多市场和地区。此外，目前可用的杀虫剂类型发生了变化，这反应了作物保护工业发生了重大变化。在过去27年中，杀虫剂的环境相容性大大提高，能更好地满足不断严格的管理要求的新杀虫剂被发现和上市。因此，在许多方面，最近27年（约从1991年以来）代表杀虫剂发现的新时代，开发的有明显销售额（＞5 000万美元，2017年的销售数据）的新类型杀虫剂数量是前50年的2倍。这表明在1991年后作物保护行业进行了大量创新，但并不意味着1990年前开发的杀虫剂没有持续价值以及与当今农业不相容。1990年以前的许多杀虫剂仍然很重要，例如合成拟除虫菊酯类杀虫剂，在近40年的时间里，它们一直占据着全球杀虫剂市场15%～20%的份额（图3）。需要指出的是，新类型杀虫剂在数量和多样性方面一直在增加，其中许多具有新的作用机制，而且还在被持续发现（表1，图3-4）。

2 杀虫剂作用机制数量

20世纪50年代和60年代的杀虫剂市场只有滴滴涕及其类似物、环二烯（及相关的有机氯）、有机磷和N-甲基氨基甲酸酯等类别（表1，图3-4）。这些化合物的作用机制只有3种：调节电压门控钠离子通道（VGSC），抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和阻碍γ-氨基丁酸（GABA）门控氯通道（表1）。20世纪60年代（图3）在美国，这些类别杀虫剂占杀虫剂市场的94%。然而，在杀虫剂抗性出现和不断增加，监管不断严格的情况下，需要引入新杀虫剂。自从第1代合成有机杀虫剂商业化以来，已发现了许多类别的杀虫剂，且这些杀虫剂成为了市场中的主要产品，如合成拟除虫菊酯类、新烟碱类、二酰胺类和一些其他类杀虫剂。其他类杀虫剂有苯甲酰脲类、阿维菌素类、多杀菌素类、季酮酸类/2,4-吡咯烷二酮（tetramic acid）和二酰肼类（表1，图4）。因此，一些较早类型杀虫化合物的利用在过去40年中大大地减少了（表1）。如前所述，现在其他类别杀虫剂和快速增长的二酰胺类杀虫剂的销售额约占全球市场的50%（图3），这说明自1991年以来商业化的新类型杀虫化合物的重要性和影响。这些新杀虫剂的作用机制包括一系列新的或正在开发（在引入）的（表1），其中包括昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的激动剂位点，它是新烟碱的靶标位点，也是以前发现的杀虫剂NP和烟碱的杀虫靶标位点。其他1991年后发现的新杀虫靶标位点有nAChR（多杀菌素）上的变构位点和GABA-门控氯离子通道[异噁唑啉、间双酰胺（meta-diamides)]、乙酰辅酶A羧化酶[ACCase、季酮酸类/2,4-吡咯烷二酮（tetramic acid）]、蜕皮激素激动剂作用位点（二芳甲酰肼类）、线粒体电子传递复合体II(β-酮腈衍生物）、GSC-阻滞剂作用位点（噁二嗪、缩氨基脲）、鱼尼汀受体上的变构位点（双酰胺）和昆虫弦音器TRPV通道（吡蚜酮、双丙环虫酯）（表1）。

表1 引入不同化学类别杀虫剂的时间和其作用机制a

续表

续表

有人认为只有有限的杀虫靶标位点可用于有效防治害虫。然而自从约30年前此文章发表以来，已发现新的作用机制（表1），但新的受体或生化过程很少（例如蜕皮激素受体、ACCase和昆虫弦音器TRPV通道）。很久以前就知晓VGSC为杀虫剂靶标（除虫菊、滴滴涕、合成拟除虫菊脂）。杀虫VGSC阻滞剂作用于VGSC中新的杀虫剂结合位点，这不是以前杀虫剂产品的靶标，但也不是对新的杀虫剂敏感的靶标位点。同样，异噁唑啉类和间双酰胺类（GABA-门控氯离子通道上的变构位点）、多杀菌素类（nAChR上的变构位点）和双酰胺类（鱼尼汀受体上的变构位点）的靶标位点是以前开发的杀虫化合物受体上的新结合位点。因此，发现的特异性靶标（例如VGSC、nAChR）系统中的结合位点数量增加了，但特异靶标数量仍相对很少。对于这些已知昆虫系统中的一些靶标，其他不同的结合位点仍未被利用，其中包括N-丁基酰胺和AaIT等蝎子毒素作用于VDSC中的位点。更重要的是开发了昆虫体内其他潜在的靶标位点，例如钙和钾通道、毒蕈碱受体、生物胺受体等GPCR和调节生物胺（如多巴胺）的系统。然而，到目前为止，除了章鱼胺受体以外，其他系统仍未被利用。也许，对这些未被利用系统的研究与导致新烟碱发现的情况相似，即只是等待新化学类型物质、不同生测方法或不同靶标昆虫和新的假设的很好地融合。烟碱长期以来被认为是一种杀虫剂，在新烟碱类吡虫啉出现之前，对烟碱类似物已经研究了很长一段时间。新化学骨架的融合，测试对不同昆虫靶标的活性（褐飞虱）使科学家将最终发现新烟碱的假设编织在一起。这和其他示例说明需要不断创新开发许多昆虫作用靶标，更重要的是发现新的作用机制。因此，商业化开发一些潜在杀虫剂靶标位点正在等待科学家合成正确的新化学类型物质，然后将其与正确的生物测定法和不同的假设相结合。

3 发现新杀虫剂：先导物产生

从杀虫剂开发历史看，有许多方法用于开发杀虫剂，有对化合物库的经验/随机筛选，天然物质为潜在产品或激发开发灵感，不同形式的生化（靶标位点）或生物合理性设计，开放性文献，竞争者的专利，生物活性骨架，对其他化学领域（除草剂和杀真菌剂）内部数据的挖掘/广泛筛选以及新型化学骨架。这些方法可被大致分为3类：天然产品或源于天然产品的启发，竞争者的启发或生物活性假设（图6）。后一种基于生物活性假设，如Loso等人所定义，是不同于从头设计或基于化学的设计和随机筛选的方法，它始于生物学假设，然后设计分子以验证这个假设（图5）。基于生物活性假设的方法所包括的策略有数据挖掘，靶标位点启发，新型骨架，骨架跳跃，基于片段、配体和形状的设计，多样性筛选和基于文献的想法（图5）。许多先导产生是发生在生物活性假设的情况下。先导产生的竞争者的启发（CI）方法不言自明。在此，竞争者的化合物被作为起点，特性假设（基于生物或传递）指导研究人员发现具有新颖药效团的新的生物活性化合物。下面将提到，基于CI的先导物生成在历史上是最常见的方法，由此开发了有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等。第3类为天然产品为基础的先导产生法，很久以来就为先导物产生的重要方法，下面将详细介绍。

图1 自1914以来杀虫剂抗性案例的累积数量

图2 A-欧洲、日本和美国进行基础发现的研发的作物保护公司的数量（从事生物制品和信息素公司除外）；B-不同欧洲国家进行发现的研发作物保护公司数量下降

图3 主要类别杀虫剂的使用随时间的变化情况

图4 商业化引入不同类别杀虫剂的大概时间和每类的活性成分数量

图5 先导化合物产生的方法

图6 自1990年以来，每年新的ISO杀虫剂名称的数量（表明一般先导化合物产生方法的分布）

第4类方法为公司内部跟进自己的产品，开发下1代产品（图5）。1个新产品的成功上市，自然有利于确定是否有可能扩展产品。此方法主要用于提高防效，拓宽害虫防治谱，或改善其他特性。如此研究常常进行，即使新产品仍在开发中。用这种方法发现的突出杀虫剂例有由甲胺磷发现了乙酰甲胺磷（对哺乳动物的选择性高）和由克百威产生丁硫克百威（对哺乳动物的选择性提高），氯菊酯产生氯氰菊酯，近而再产生溴氰菊酯（效力提高了），由阿维菌素产生甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（防治谱增加），由吡虫啉产生噻虫啉（叶面施用效率提高），由虫酰肼产生甲氧虫酰肼（防效提高），由吡螨胺产生唑虫酰胺（防治谱增加），由多杀菌素产生乙基多杀菌素（防效、防治谱和残留活性提高），由螺螨酯产生螺甲螨酯，近而产生螺虫乙酯，由氯虫苯甲酰胺产生氰虫酰胺（cyantraniliprole）（防治谱和迁移性提高）。

3.1 不同先导物产生方法的影响

通过查询最近27年中向国际标准组织（ISO）申请通用名称的新杀虫剂化合物来确定不同先导化合物产生方法的影响。可能的话，确定用于自1991年以来向ISO呈交通用名的114个新杀虫剂的先导物产生方法（NP、CI、生物活性假设）（图6）。目前，这些杀虫剂的73%已商业化，7%已停止开发，20%为新的/仍在开发中。大部分新杀虫剂的先导物为基于CI开发的，其次为生物活性假设发现（图6）。对这些更新的杀虫剂的更详细分类（7A)表明42%是基于CI，29%是基于生物活性假设的方法和13%是基于下一代的方法开发的。NP为最小的部分，只占7%。然而，如追寻某些竞争者启发的化合物和下一代化合物的来源时，NP的影响要大得多，因为许多化合物的来源都可以追溯到NP。这样考虑的化，NP的影响就更大了，其中17%ISO杀虫剂是直接或间接基于NP开发的（图7A）。

图7 A-自1990年以来，新ISO名命的杀虫剂的先导物的产生源(包括77个化合物，不包括有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯）；B-目前主要类别杀虫剂（基于2017年的销售额）的起源（先导物产生方法，见图5和文中）

3.2 作为新杀虫剂模板的天然产品

天然产品一直重要，但与其他先导物产生法相比，是最近新杀虫剂发现较少利用的来源（图7A）。然而，当根据当前（2017年）全球杀虫剂销售（图7B）来分析IRAC作用机制分类法确定的当前杀虫剂类别的来源时就会发现NP的作用很大，基于NP开发的杀虫剂销售额达到总的37%左右。相比之下，受竞争对手启发的方法并没有产生代表杀虫剂新类别的许多产品。但VGSC阻滞剂类别（IRAC类别22）的噁二嗪类和氨基脲类，和最近间双酰胺和异噁唑啉类杀虫剂是例外。但是，以前数据表明这些是例外，而不是常规。

尽管NP对新ISO杀虫剂的影响不大，但NP的潜在影响却要大得多。对于通过其他方式发现的杀虫剂化学类别，NP有潜力作为其中许多类别的模板。明显的例子是新烟碱类，其起源于发现硝虫噻嗪（nithiazine）的信息，硝虫噻嗪是发现吡虫啉的基础。新烟碱类与NP烟碱的关系显然，在不同情况下，烟碱或地棘娃素可能潜在地启发新烟碱类的设计。NP可能启发合成杀虫剂的相似例子有有机磷、蜕皮激素激动剂、线粒体电子运输位点-1（MET I）抑制剂，还有有争议的苯基吡咯类。因此，如此看来，NP对杀虫剂发现和销售的真正和潜在的影响重大，达到2017年全球杀虫剂销售额的75%以上（图8A）。因此，NP作为杀虫剂发现的模板和启发一直是新化学类型杀虫剂发现的重要起点。有趣的是，植物源NP一直是杀虫剂化合物的巨大来源。作为N-甲基氨基甲酸酯和合成拟除虫菊酯等杀虫化学物质的启发物质以及天然代谢物，理论上讲新烟碱、OP、苯基吡咯类或MET I抑制剂可能由其衍生（图8B）。而阿维菌素类和多杀菌素类等一些较新的杀虫产品是在微生物基础上开发的。

和其他先导物产生方法一样，NP法也存在一些问题和优势。新NP的发现是一个漫长而具挑战的过程，这潜在地降低了由NP发现先导物的几率。此外，一旦分离和鉴定，NP可能是具有许多立体中心的复杂分子，使得基于它们的杀虫剂设计过程漫长而复杂。因此，以NP为基础开发杀虫剂可能比其他先导物产生方法需要更多时间。而优势为NP具有未被发现的新的杀虫剂作用机制，如阿维菌素类、多杀菌素类、沙蚕毒素类似物、鱼尼汀、双丙环虫酯和其他（表1），但需要提供更多激励来维持NP为先导物产生工具。利用合成生物学和基因工程也可提供已知NP的新的类似物或全新的NP。例如，通过对相关生物合成途径进行基因修饰得到阿维菌素类和多杀菌素类的新的类似物。

图8 A-天然产品对当前主要杀虫剂类别（基于2017年的销售额）的影响（真正和潜在的）；B-NP来源的主要杀虫剂类别（实际的和潜在的）

3.3 发现杀虫剂的工具

在最近27年中，有许多新工具用于发现新的作物保护化合物。用于快速制备的化合物库和高通量筛选（HTS）技术已普遍用于作物保护工业20多年。和医药工业不同，作物保护工业具有活体高通量筛选开发的优势，能够在96孔板或相关系统中，以重要害物为靶标进行小型化生测，尽管吞吐量可能小于许多离体生测法。用于HTS测定的理想害物有蚜虫[例如烟蚜（Myzuspersicae)]和鳞翅目[例如实夜蛾（Heliothisspp）,Spodopteraspp)]等重要害虫,以及Drosophila melanogaster或蚊子（例如Aedes aegypti）等模型昆虫，这些都是较大昆虫类别代表，因此有能力在测试过程中较早显示活体活性。

作为筛选和先导物产生过程的补充，计算机或输入潜在化合物的虚拟筛选也被广泛用于作物保护工业。计算机筛选集中于筛选推断具有ag-like和lead-like特性的化合物，以及根据事先的筛选结果强调与某些害虫相关的基于计算的化学指纹。此外，潜在输入的三维版本可虚拟筛选对受体模型或靶标酶的活性。这些方法的最终结果是，在进行任何生物测定之前，增加发现新的活性先导化学物质的可能性，同时将需要购买或合成的化合物的数量减至最少。因此，计算机筛查的使用可以保持HTS筛查程序易于管理，同时提高了发现新的活性化学物质的可能性。

虽然被广泛利用，但基于离体靶标位点的HTS远不是已成为商业产品的新杀虫化学物质发现的主要因素。理论上，对已选靶标位点有高度活性的化学类别的确定可能有高度的优势。然而，对靶标位点的活性仅仅是成功设计新杀虫剂的一个因素。根据靶标位点对化学物质的优化常常使化合物具有无法活体传递到害虫或活体靶标位点的物理特性。常常，最终开发的杀虫产品对靶标位点的活性不是最高，但却是实际可用于农业的成本和特性的最佳结合体。然而，随着对杀虫剂-害虫-植物-环境间相互作用了解的不断增加，用计算机方法优化与杀虫剂效力有关的靶标位点活性和所有其他参数可能是开发过程中更好利用离体数据的一个途径。

定量构效关系（QSAR）和计算机辅助分子设计（CAMD）等计算机方法是发现和开发新杀虫剂和了解作用机制的主流方法。作为最早的计算机辅助法之一的评估杀虫剂效力的QSAR分析法已被开发了几十年。然而，QSAR常用于了解化学领域，很少被成功用于设计或优化杀虫化学物质使其产品化。一般，计算机方法用于先导产生过程中来优化或了解增加或限制化学物质活性的参数。这样，它们为专注于化学特定领域的先导物产生科学家提供了一个视角，可用来查看化学结构并形成假设以进行测试，作为化学结构改进计划的一部分。类似地，QSAR、CAMD和相关的计算机方法也能辅助了解杀虫剂与靶标位点的作用，还能提供优化指导。有趣的是，计算机工具也能辅助制定何时结束化学研究的决策。

4 总结——杀虫剂发现的新时代

如上所述，从许多方面来讲过去的27年都是杀虫剂发现的新时代，在这期间发现了许多新的杀虫剂化学类别（例如新烟碱类、二酰胺类、双酰肼类、多杀菌素类、亚砜亚胺类、间二酰胺类、异噁唑啉类、pyropene等）和数种新作用机制（表1）。在过去27年中有显著销售额（≧50 MM USD）的商业化化学杀虫剂的新类别是前50年的2倍，有更多在开发中，这也支持以上观点。这说明最近几年已开发或正在开发的杀虫剂新类别的扩展。重要的是，其中许多新化合物作用机制新颖或未知，因此有可能为害虫控制和IRM提供新的选择。

虽然在近年发现了更多的杀虫剂新类别，但这些类别的每一种的化合物量，特别是1991年以来可能比1990年前的类别（OP、氨基甲酸酯、酰基脲类、拟除虫菊酯类等，图4）要少。先导物产生的一个考虑因素是，在现有化学领域（基于CI）周围寻找新的化学空间所需的时间可能与开发新的杀虫化学领域所需时间没有什么不同。因此，能够快速进入基于CI的先导物产生的相关化合物领域的优势可能比预期的少。在欧洲、日本或美国进行基于CI的研究公司在1991年后很少。因此，一旦发现新的化学领域，可能就会有比过去有更少的基于CI的类似物。此外，在过去27年中，CI启发发现的杀虫类似物的特性可能要少于此类别的第一个化合物，这进一步说明全新类别化合物的优势。

对自1991年以来ISO杀虫剂名称申请时间的分析是衡量近年作物保护工业新开发的化学产品的措施。公开的新杀虫剂数量在1993年达到峰值，在接下来的20年中此数值相对稳定，在约25年间（1994-2018年）每年平均3.6个新杀虫剂，在老的类型杀虫剂（OP、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类）淘汰后，每年2.9个。因此，尽管开发和登记新的作物保护化合物的费用和时间增加，以及许多公司投入大量资源来研究和开发生物制剂和转基因植物，在过去的20年中，作物保护工业新杀虫剂的总产量相对稳定。重要的是对发现和开发新杀虫剂的兴趣和需要仍很大，特别是考虑到作为IPM和IRM项目的工具，具有新作用机制的杀虫剂在市场中的溢价情况。