感染模式对HBV感染者精液质量和精子DNA碎片化指数的影响*

武新梅,陈 华,陈允国,刘文芹

温州医科大学附属第二医院：1.检验科；2.生殖中心；3.急诊科,浙江温州 325027

乙型肝炎病毒(HBV)感染对人类的健康和生命造成了严重威胁,我国属乙型肝炎高发区。不孕不育人群中也有相当比例的HBV感染者[1]。研究发现,HBV为非单一的嗜肝病毒,除感染肝细胞成为导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要潜在因素外,还可以穿透人血睾屏障,侵入生殖细胞,影响精子质量,降低男性生育潜能[2-3]。本研究分析了236例男性HBV感染者的精液常规参数和精子DNA碎片化指数(DFI),研究不同HBV感染模式男性这些指标的情况,旨在探讨HBV感染者不同的感染状态是否影响男性生育能力,从而为HBV感染影响男性生殖细胞的机制研究提供相关依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2018年12月在本院就诊的236例男性HBV感染者为研究对象,排除标准:无精子症患者；肝功能异常者；近半年有持续高热者；精液白细胞密度>1×106/mL者；染色体异常者；禁欲时间不符合要求者。

1.2方法 收集乙型肝炎5项标志物检测结果,根据患者的3种主要感染模式分为3组,HBsAg+/HBcAb+、HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+和HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+患者分别纳入A组(58例)、B组(112例)、C组(66例)。HBV标志物采用ELISA检测,试剂盒由上海科华生物技术公司提供。

1.2.1精液标本收集 所有入组的男性均禁欲2～7 d,手淫取精,37 ℃静置30 min待其液化,2 h内用计算机辅助精液分析系统(CASAS)进行精液常规分析,检测指标包括精液体积、精子密度、精子存活率、精子活力和精子畸形率。具体参照WHO第5版《人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》[4]。精子形态学分析参照WHO推荐的巴氏染色法。

1.2.2DFI检测 采用染色质扩散法(SCD)进行DFI检测,试剂盒购自深圳市博锐德生物科技有限公司,检测方法和判断标准参照文献[5]。

2 结 果

C组年龄明显低于A组、B组,差异有统计学意义(P<0.05)；A组与B组间年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。A组体质量指数(BMI)明显低于B组、C组,差异有统计学意义(P<0.05)；B组与C组间BMI比较,差异无统计学意义(P>0.05)；禁欲时间、精液体积、精子密度、精子存活率、前向运动精子比例和精子形态正常率等参数在3组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)；尽管C组精子密度和精子形态正常率低于A组、B组,但差异无统计学意义(P>0.05)。C组DFI明显高于A组、B组,差异有统计学意义(P<0.05)；A组、B组间DFI比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1HBV感染者男性基本情况和生育力相关常规参数比较

注:与C组比较,*P<0.05；与B组比较,#P<0.05。

3 讨 论

近年来,随着辅助生殖技术的快速发展,辅助生殖人群中的感染性疾病也受到越来越多的关注。HBV感染是其中最常见的病毒感染性疾病,12%左右的患者为慢性HBV感染者[1]。值得注意的是,男性HBV感染者不仅存在通过性生活传染给配偶的可能,也有通过精子将病毒DNA垂直传播给下一代的风险。

血液中的HBV可能通过受损的血睾屏障进入生殖系统,但血睾屏障的受损是否与HBV感染有关,有待进一步研究。侵入的HBV存在于精液和各级生精细胞中,对男性生育力的影响首先体现在精液常规参数上,即精液体积、精子密度、精子存活率、精子活力和精子形态等。VICARI等[6]和ALI等[7]对HBV感染的原发不育男性的精液常规参数的分析发现,HBV感染者的精子密度、前向运动精子比例和精子存活率明显低于健康者,而且血清HBV DNA含量越高,精子质量越差。LORUSSO等[8]的研究也发现,HBV感染者的精子活力和精子存活率明显低于未感染者。国内郑九嘉等[5]对273例HBsAg阳性者和254例HBsAg阴性者研究发现,HBsAg阳性者的精子密度、精子活力均明显低于HBsAg阴性者。但也有研究认为,HBV DNA阳性和阴性的男性精液各参数间没有明显差异[9-12]。最近也有研究发现,虽然HBV DNA阳性组和阴性组之间的精子数量(包括精液体积、精子密度)差异无统计学意义(P>0.05),但阳性组精子存活率、前向运动精子比例、平均直线速率、平均路径速率明显降低[13]。出现研究结果差异的原因,除研究人群、样本量、地域等因素外,研究分组方法也有重要影响[14]。前期的研究主要以HBsAg或HBV DNA是否阳性作为主要分组依据。相关研究发现,HBsAg阳性患者中HBV DNA阳性率为31.3%,HBeAg阳性患者中HBV DNA阳性率高达62.15%,甚至更高[15],可见不同的试验分组依据会产生不同的研究结果。HBV影响精子活力参数的机制尚不十分清楚,可能与HBV相关蛋白干扰精子线粒体膜电位,影响供能有关[16]。与以往研究不同的是本研究纳入的236例患者均为HBsAg阳性患者,根据患者不同的HBV感染模式(HBsAg+/HBcAb+、HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+和HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+)分为A、B、C 3组,虽然C组的年龄明显低于A、B两组,但精子密度、精子存活率和前向运动精子比例仅稍低于A、B两组,吴娟子等[12]的研究也得到了相似的结果。

精子形态学分析在男性不育的诊断和治疗中发挥重要的作用。相关研究认为精子形态与顶体反应、透明带结合试验、核染色质完整性等参数密切相关,对胚胎发育及辅助生殖治疗结局有一定的预测作用[17]。高正洪等[11]认为HBV携带与否并不增加精子畸形比例。郑九嘉等[5]对HBsAg阳性患者的精子形态学分析发现,虽然精子形态正常率都在正常范围,但HBsAg阳性组的精子形态正常率、颈部和尾部畸形的精子比例均明显高于HBsAg阴性组。已有的研究认为,随着年龄的增长,睾丸灌注减少、生理功能下降,这种下降首先应该反映在精子形态上[18]。但本研究中,在C组年龄明显低于A、B两组的情况下,其精子形态正常率差异却无统计学意义(P>0.05)。吴娟子等[12]发现,在“大三阳”患者组发现了较高的精子畸形率,本研究的C组患者均为“大三阳”感染模式。提示年龄是否影响精子形态，有待进一步深入研究。另外,精子形态正常与否在一定程度上反映了精子染色质浓缩程度和DNA片段化水平[17],这也可以通过本研究的DFI分析结果得到进一步验证。

精子DNA是男性遗传信息的载体,DFI对于正常受精和胚胎继续发育具有重要意义[19-20]。精子染色质的损伤可导致不育,尤其是当DFI大于30%时,生育能力明显下降[21]。活动的人类精子能够主动捕获HBV DNA,HBV DNA则以多位点随机的方式整合到精子基因组中,一方面增加精子染色体的不稳定性[22-23]；另一方面整合了HBV DNA的精子可通过受精和胚胎发育发生父婴垂直传播[3,7,22]。相关研究认为,HBV感染者精子DFI比例明显高于未感染HBV者,并且随着血液中HBV DNA拷贝数升高,精子DNA损伤加剧[13]。本研究中C组DFI明显高于A组、B组,说明DFI与患者的感染模式有关。由于HBV DNA阳性提示病毒在体内处于活跃状态,而“大三阳”患者有更高的HBV DNA检出率[11]。成熟精子DNA是单倍体,精子不具有进一步分裂和繁殖的能力,DNA含量的改变、染色质的缩合不良可能是导致男性生育力低下的分子原因[3,7,22]。当然“大三阳”患者的高DFI比例也可能与抗病毒药物的治疗有关,具体机制有待进一步深入研究。

综上所述,通过对HBV感染者精液常规参数和DFI的分析,本研究发现不同感染模式间精液常规参数和DFI存在差异,尤其是C组的“大三阳”感染模式对患者的精液质量及DFI影响明显。根据研究结果推测,HBV侵入精子后,一方面通过与精子基因组的整合影响精子DNA的稳定性,增加染色体畸变概率；另一方面,HBsAg蛋白作为外源蛋白侵入时引起机体炎性反应和免疫应答,造成精子功能、细胞器线粒体功能的破坏,进而影响精子质量。