新型冠状病毒检测方法的应用现状

杨 梅，张晓天，刘秀敏，武 婧，朱洪权

(吉林大学第二医院 检验科，吉林 长春130041)

2019年12月，湖北武汉出现了新型冠状病毒肺炎，疫情迅速蔓延至全国各地区甚至全球多个国家[1]。新冠肺炎的病原体是新型冠状病毒，主要传染源是病毒感染的患者和无症状携带者，通过飞沫和直接接触的方式传播，且该病毒传染性强，人群普遍易感。患者以发热、干咳、乏力为主要表现，少数伴有鼻塞、咽痛和腹泻等症状。重型、危重型患者可能出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征，甚至多器官功能衰竭等，老年人和有慢性基础疾病者预后较差[2]。因此，精准的诊断对于疾病治疗和疫情防控至关重要。

SARS-CoV-2的病原学和血清学检查标本可来源于血液、粪便[3,4]、鼻咽拭子、痰、肺泡灌洗液和其他下呼吸道分泌物。目前主要依据的实验室阳性诊断方法为：(1)实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；(2)病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；(3)血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血清学新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高[2]。本文对目前常用的SARS-CoV-2基因测序、荧光RT-PCR核酸检测和血清特异性抗体检测方法的基本原理和应用现状进行以下综述。

1 基因测序

基因组是生物体内遗传信息的总和，利用高通量测序平台对病毒基因组序列深入分析为我们认识和诊治新冠肺炎提供可靠的依据。由2019新型冠状病毒资源库可知，SARS-CoV-2基因组约29000个核苷酸，12个开放读码框(ORF)，为线性单股正链RNA病毒[5]。数据分析显示，SARS-CoV-2与SARS-CoV有80%的全基因组序列几乎相同，与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性高达88%[6,7]。但SARS-CoV-2基因组ORF 1ab区域的RNA聚合酶基因(RdRp)与SARS-CoV显著不同，属于一种全新的β群冠状病毒[8,9]。

WU F等[10]利用MiniSeq(Illumina)平台对患者支气管肺泡灌洗液(BALF)测序，确认了SARS-CoV-2完整的基因组序列并上传至GenBank(注册号MN908947)，依据其核苷酸序列评估SARS-CoV-2与已鉴定冠状病毒间的进化关系。Chen L等[11]利用基于RNA的宏基因组下一代测序检测两名急性呼吸症患者(有华南海鲜市场接触史)的BALF，迅速鉴定出样品中唯一的病原体-新型冠状病毒，且丰度水平很高。LU R等[12]采用基于高通量宏基因组测序的DNBSEQ-T7平台对BALF样本进行下一代测序(NGS)，证明SARS-CoV-2与SARS-CoV类似，通过S蛋白结合宿主细胞的血管紧张素转换酶Ⅱ(ACEⅡ)受体致病，并观察到病毒受体结合域中的几个关键残基可变，即能产生新的种株或亚型。Wang M等[13]开发了纳米孔靶向测序技术，这一方法可同时检测和区分SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒，与目前常用的qPCR试剂盒相比假阴性率明显降低，另外，该技术已经检测到SARS-CoV-2的核苷酸突变。

高通量测序方法准确性高、敏感性高，能够得到病毒精确的全基因组序列，有利于掌握病毒的遗传信息、了解致病机制；有利于潜伏期低病毒含量标本的检测，和对荧光定量PCR/抗体检测可疑结果的确认；也有利于监测病毒的变异，指导开发可靠的诊断试剂盒。与其他方法相比基因测序占据着无可替代的优势，但是，测序所需仪器成本高，对实验室和实验人员要求高，样本检测和结果分析周期长，难以满足COVID-19爆发时的检测需求。因此，疫情时期大量样本的检测仍需结合其他方法。

2 实时荧光RT-PCR核酸检测

实时荧光RT-PCR技术是WHO推荐的MERS-CoV检测方法之一，我国新冠肺炎诊疗方案已将呼吸道分泌物、血液标本病毒核酸阳性作为COVID-19的诊断标准之一[2]。疫情初期，国家疾病预防控制中心对SARS-CoV-2进行序列确认和公布，推荐了基因组中用于核酸检测的保守序列区域：开放读码框(ORF 1ab)、核衣壳蛋白N基因。截至2020年3月27日，已有10个基于荧光PCR的新冠病毒检测试剂盒获得国家药品监督管理局批准[14]。

SARS-CoV-2是RNA病毒，先将RNA逆转录为DNA，若样本存在靶序列，TaqMan探针与模板结合，DNA链扩增发出荧光，检测荧光达到阈值时的Ct值，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。试剂盒检测原理基本一致，但官方并未规定检测引物和探针序列，有些试剂盒检测三个靶基因区域(ORF 1ab、N基因和E基因)，有些检测两个区域(ORF 1ab、N基因)，还有的是单基因区域检测，如华大生物科技的试剂盒只靶向检测ORF 1ab基因。也有学者建议，将ORF 1ab作为诊断序列，将N基因作为筛检序列[15]。

除了研发试剂盒之外，对于弱阳性标本需开发敏感度更高的检测方法。近期，张锋教授团队[16]开发了一种基于CRISPR的SHERLOCK技术的新方法，能够快速检测SARS-CoV-2的特异性RNA。经测试，该方法能在很低的RNA溶度(10-100 copies/uL)下，准确检测到病毒RNA序列。杨祥胜等[17]研发了一种多重探针扩增(MPA)技术，将TaqMan技术和溶解曲线相结合，实现多重检测多个靶标，覆盖包括SARS-CoV-2在内的18种呼吸道病毒，临床注册检验结果表明最低检出限≤100 copies/uL。微滴式数字PCR(ddPCR)对样品进行微滴化处理，直接计算模板中的拷贝数，为H7N9的病毒监测和治疗提供了很大帮助[18]，可参考用于SARS-CoV-2检测。新技术试验结果固然令人惊喜，但目前仍处于研究阶段。

虽然，荧光RT-PCR检测技术作为新冠肺炎诊断的“金标准”，具有灵敏度高、特异性强和检测周期短的优势，但仍存在如下因素造成检测结果不准确。(1)各产品选择扩增的序列不一，试剂敏感度、特异度不同。郭元元等[19]用6种试剂盒同时检测1例弱阳性患者不同时期的咽拭子标本，结果显示只有C试剂和F试剂检测性能较理想。(2)标本采集类型。肺中表达ACEⅡ的细胞有80%以上是Ⅱ型肺泡上皮细胞，即下呼吸道分泌物(如痰、肺泡灌洗液)的检测效果可能优于上呼吸道(如咽拭子)。陈炜等[20]的研究结果当即显示患者痰标本的病毒核酸含量均高于咽拭子。(3)标本采集时期。一般的快速抗原检测在1周左右往往呈阴性[21]，董玉颖等[22]证明确诊患者暴露第2周其咽拭子标本核酸检测阳性率才达100%，且随时间推移其阳性率逐渐降低，即采样过早或过晚均影响核酸检测结果。(4)样本运输及保存。标本应置于病毒保存液中，常温下应4 h内检测，24 h内能检测的样本可置于4℃保存，24 h内无法检测的应置于-70℃或以下保存[23]。综上可知，仍然需要寻求其他检测方法来弥补核酸检测“假阴性”的漏洞。

3 血清特异性抗体检测

SARS-CoV-2感染机体后，最先能被检测到的是其遗传物质RNA,随着病程进展，人体免疫系统会产生抗体，主要是IgM和IgG两种。

IgM是体液免疫最早(约发病后5天)合成和分泌的抗体，其升高提示近期感染，但可能因类风湿因子、自身抗体等干扰导致假阳性，因感染后两周IgM开始衰减甚至消失造成假阴性结果；IgG是一种保护性抗体，产生较晚(约发病后14天)持续时间较长[24]，其阳性提示病情进入中后期或既往感染。所以，单独的IgM或IgG抗体检测易出现假阳/阴性，建议检测IgM/IgG总抗体以辅助诊断疾病不同感染阶段，使SARS-CoV-2感染检测进入“核酸为主，抗体为辅”的联合检测局面。常用的抗体检测技术主要包括：胶体金免疫法、化学发光免疫法和酶联免疫吸附试验等。截至2020年3月27日，国家药监局已应急批准新冠病毒抗体检测试剂8个[13]。

3.1 胶体金免疫法

胶体金免疫法是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，用于抗原抗体反应的标记免疫测定技术。其基本原理(以万孚新冠病毒抗体检测试剂盒为例)是：将金标抗原包被在硝酸纤维素膜上，当血清中含有SARS-CoV-2特异性抗体时，则形成SARS-CoV-2特异性抗体-金标抗原复合物，通过层析作用复合物流向检测区，形成金标抗原-SARS-CoV-2特异性抗体-第二抗体复合物，显色；多余的金标抗原继续扩散至质控区，显色表示结果在控。胶体金法操作简便、快捷，且样本不需要离心，可以减少气溶胶污染。

赵瑾等[25]采集确诊组、康复组和对照组共212个血清样本，用胶体金免疫层析法进行检测，结果显示该方法的检测灵敏度71.31%，特异度98.92%，准确度82.07%。罗效梅[26]等以RT-PCR核酸检测为金标准，采集101例患者和54例对照者的外周血，测试胶体金免疫层析法，结果表明该方法检测SARS-CoV-2特异性IgM/IgG抗体的敏感度为92.1%，特异度90.7%，准确度91.6%。胶体金法检测的特异度和灵敏度较好，所需样本量少，可在20分钟内得到结果，且试剂盒易于标准化和商业化，比较适用于大规模人群的筛查。

3.2 化学发光免疫法

化学发光免疫法是将发光分析和免疫反应相结合用以检测微量抗原或抗体的新型标记技术，可以定量检测未知抗体，目前已广泛用于临床。其基本原理(以磁微粒化学发光-间接法为例)是：若样本中有SARS-CoV-2抗体与荧光素标记抗原结合，加入包被抗荧光素抗体的磁微粒，形成SARS-CoV-2抗体-荧光标记抗原-磁微粒复合物1，在外加磁场中沉淀、去上清，加入酶标二抗，形成酶标二抗-复合物1结合体，去上清加入酶促底物，底物被酶催化产生发光反应，计算机处理系统可将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗体的浓度。

李泉[27]等采用化学发光法对确诊组、疑似组和对照组共102例血浆标本进行检测，结果证明SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体检测灵敏度为96%，特异度100%。沈花等[28]采用化学发光微粒子免疫法定量检测血清SARS-CoV-2总抗体，结果证明其灵敏度为93.5%，特异度100%，准确度96.8%。唐鹏[29]等同时采用化学发光法和胶体金法检测IgM/IgG抗体，结果显示两方法检测特异度均为100%，但对于核酸检测阳转阴组，其总抗体的阳性检出率分别为95.2%和76.2%，而对疑似组的检出率分别为94.9%和70.5%，认为化学发光法检测SARS-CoV-2总抗体明显优于胶体金法。实验数据表明，化学发光法检测血清总抗体得灵敏度、特异度均较高，可用于辅助诊断SARS-CoV-2感染。

3.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是国际上通用的抗体检测方法[30],是在抗原抗体免疫反应的基础上，借助酶的催化作用，通过定性或定量检测有色产物的量确定待测抗体的含量。ELISA需要采取离心操作，且步骤繁琐，检测速度慢，目前仍没有新冠病毒检测产品通过国家药监局的批准。

血清学抗体检测方法的优势在于：(1)对实验室及实验人员要求低，适合各级医院开展，有助于大量样本的筛检。(2)可减少荧光RT-PCR核酸检测的漏检风险，提高感染者检出率。(3)实现患者体内抗体含量动态监测，为感染者病情评估和治疗方案提供重要依据。(4)用于传染病既往感染规律的流行病学研究，对SARS-CoV-2等病毒的感染防治和疫苗研发具有重要的参考价值。但抗体检测仍然只能作为核酸检测的辅助手段，不能取而代之。

4 总结

SARS-CoV-2的传染性强、传播速度快，早发现、早隔离、早治疗对于疾病的防控意义重大。但基因测序检测周期长，PCR核酸检测漏检率高，而且由于SARS-CoV-2与其他冠状病毒的同源性较高，血清抗体检测可能会出现N蛋白和S蛋白的抗原交叉反应。所以，单一的检测方法或多或少会存在局限性，只有通力合作、相辅相成，才能完成基因序列识别、样本筛查和疾病诊断等一系列工作，更好的为临床服务。