肝素结合蛋白的临床应用研究进展

牛晓东 吕欣哲 冯忠军

肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)又被称为CAP37或天青杀素，是中性粒细胞受到外界刺激释放产生的功能多样的颗粒蛋白。因有广泛抗菌活性、趋化特性、促使血管渗漏，使其成为新兴的感染性疾病相关生物标志物。据有关研究发现HBP在脓毒症患者的早期诊断和疗效监测中优势尤为明显，在尿路感染、细菌性脑膜炎、肺部感染等其他感染性疾病中也有一定的应用价值，但HBP发挥其功能的分子机制尚不清楚，学者普遍认为的HBP受体尚未发现，体外重组HBP作为治疗干预作用的靶点有待证实，HBP的研究任重道远。本文就HBP的功能特性以及其在临床应用进展做一综述。

1 概述

1.1 肝素结合蛋白的发现 Shafer等[1]首次从人多形核粒细胞噬天青颗粒物中提取一种阳离子抗菌蛋白，因其分相对子量为37 kD所以被称为CAP37。后来Gabay等[2]从人多形核白细胞嗜天青颗粒中分离出一种未被鉴定的具有抗菌活性的蛋白质，并将其命名为天青杀素。Flodgaard等[3]利用肝素亲和层析技术分离出了对单核细胞和成纤维细胞具有趋化性HBP。CAP37和天青杀素的氨基酸序列、核酸序列、cDNAs显示CAP37、HBP、天青杀素属于同一种蛋白质[4-6]。

1.2 HBP的生物学特性及定位 HBP是人多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)迅速动员的一种多功能不活跃的丝氨酸蛋白酶同系物，其与中性粒细胞弹性蛋白酶的结构类似，且同源性为45%，与其他颗粒衍生丝氨酸蛋白酶的同源性为30%～70%[6]，由于取代了丝氨酸蛋白酶特有的2个残基而失去了裂解肽键的能力。免疫荧光显微镜显示HBP的定位接近质膜，深入分析分离空泡化后的中性粒细胞后核上清液进一步说明HBP储存在噬天青颗粒和分泌囊泡中，但也有一小部分可以在质膜中检测到，其中74%在噬天青颗粒中，18%在分泌囊泡中，8%存在于质膜上。并指出中性粒细胞成熟后更易于HBP的合成和动员[7]。

1.3 HBP的功能

1.3.1 抗菌活性及对血管通透性的影响：HBP作为一种阳离子抗菌蛋白有广泛的抗菌活性，主要对抗革兰阴性菌，并且强烈依赖于离子强度和pH值。HBP三维结构显示HBP蛋白结构中1个由16个碱性氨基酸残基组成的高阳离子区域位于分子的一侧，使其具有很强的极性，McCabe等[8]的实验则表明这个高阳离子区域有助于HBP的肝素结合和抗菌活性。此外，HBP在体外可以诱导内皮细胞单层Ca2+依赖的细胞骨架重排和细胞间隙的形成，并促进体内微血管中大分子物质的外流，总的作用是导致血管渗漏和水肿的形成。他们还发现链球菌表面释放的M蛋白和纤维蛋白原形成的复合物通过与β2整合素结合可以促使中性粒细胞释放HBP[9,10]。

1.3.2 趋化特性：HBP作为一种趋化分子释放入血后对免疫细胞和免疫分子有很强的影响，HBP可以作为单核细胞和巨噬细胞的趋化因子和活化剂，促进单核细胞与内皮细胞的粘附并刺激炎性单核细胞的外渗。在细胞因子的产生和修饰中同样起到了非常重要的作用，比如，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)存在的情况下，HBP可以增强肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素(interleukin-6,IL-6)的释放[11]。Heinzelmann等[12]也做过类似的实验，单纯的HBP刺激单核细胞可以诱导IL-8、巨噬细胞抑制蛋白Macrophage (inhibitor protein-1α,MIP-1α)和TNF-α的产生，当用HBP+LPS刺激单核细胞后，HBP可以增加LPS诱导的IL-8、MIP-1α、TNF-α和IL-1β的产生，但是HBP并没有增加LPS诱导的IL-10、单核细胞趋化蛋白MCP-1和IL-12的释放，从而可以得出结论，HBP不是LPS诱导的单核细胞活化的一般增强剂，而是一种靶向产生不同介导因子的分子，包括促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β，而不是抗炎性因子IL-10和IL-12。

2 HBP在临床中的应用

HBP问世以来就受到了专家学者的广泛研究，特别是其在临床中的应用价值，时至今日HBP在感染性疾病中的应用研究最多也应用最广，比如在脓毒症、细菌性性脑膜炎、尿路感染、肺部感染等的应用，同时也发现在创伤性疾病、阿尔茨海默症、动脉粥样硬化、角膜愈合等HBP同样显示了其独特的预测价值和超强的调节功能。由于HBP主要是由PMN受到外界刺激所产生释放，所以健康人血液中HBP的含量很低，一般<10 ng/ml，当有感染发生时，血中HBP的水平会升高，一般感染时HBP能达20～30 ng/ml[13]，ICU中严重感染者可达100 ng/ml，甚至>1 000 ng/ml，此时患者可能面临随时死亡的危险。因此HBP的连续监测对临床感染患者来说意义重大，特别是有严重感染的患者。

2.1 预测早期脓毒症及器官功能障碍的发生 脓毒症作为感染性疾病最主要的死因，早期诊断以及抗生素的及时应用是治疗的关键，目前脓毒症的诊断主要依靠白细胞计数、体温、心率、呼吸频率、血压等全身症状，然而这种诊断标准缺乏特异性；细菌培养这个“金标准”的试验结果相对迟缓；但而像降钙素原(procalcitonin,PCT)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-6、趋化因子等虽然有一定的灵敏度和特异性，却是评估预后较好的指标，因此急需一种既可靠又能在脓毒症早期出现血清学生物标志物。中性粒细胞是最先迁移到炎性部位的炎性细胞，在脓毒症的发生和发展中发挥重要作用，而HBP是中性粒细胞受到外界刺激释放的颗粒蛋白，这也为HBP在脓毒症中的应用找到了依据。2015年第六版《中华内科学》公布的“中国脓毒症/脓毒症休克治疗指南”已经把HBP列入其中，并指出HBP是脓毒症早期诊断的性能最优指标[14]。Linder等[15]在一项研究中发现当截断值为15 mg/ml 时，HBP是预测严重脓毒症较好的指标。在另一个研究中他们收集759例疑似感染患者的血浆标本，检测其在12～24 h后HBP、PCT、CRP、乳酸和白细胞计数水平，在诊断为感染的674例患者中有487例登记时没有器官功能障碍综合征，在这487例患者中有141例在72 h内发展为器官功能障碍综合征，其中78%的患者在发生器官功能障碍综合征之前血浆HBP水平升高(>30 ng/ml)，与其他生物标志物相比HBP是预测严重感染致器官功能障碍综合征进展的最好标志物[16]。另外，研究表明病原菌是脓毒症的主要致病因素，特别是革兰阴性菌，而HBP的抗菌活性主要针对革兰阴性菌[2]，可以大胆猜想：脓毒症患者HBP的释放或许是为了对抗病原菌。

2.2 作为尿路感染的潜在标志物 尿路感染在住院患者中占有一定的比例，但尿路感染诊断的难度却不小，以往的诊断主要依靠临床症状结合快速试纸条、亚硝酸盐、白细胞计数的结果，然而已经证明，与尿培养这个“金标准”相比，仍然有一定的诊断错误率。HBP作为一种新兴的诊断及预测不同细菌感染的的标志物对成人尿路感染的预测价值如何呢？有学者进行了尿HBP、IL-6、白细胞、亚硝酸盐比较的试验，结果表明尿HBP作为诊断尿路感染的敏感度和特异度分别为89.2%和89.8%，阳性预测值和阴性预测值分别为90.2%和88.8%，与其他标志物相比是诊断尿路感染最好的标志物，受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积为0.94。而且HBP在鉴别膀胱炎和肾盂肾炎方面有明显的优势[17]。Kjolvmark等[18]对儿童尿路感染HBP水平也做过研究，结果显示当尿HBP的截断值为32 ng/ml时，检测儿童尿路感染的敏感性和特异性分别为93.3%和90.3%，ROC曲线显示尿HBP比尿白细胞计数和IL-6有更好的特异性，比尿亚硝酸盐结果有更高的敏感性。此外，研究还表明，所有临床相关细菌显著生长的患者其尿HBP水平都会升高[19]。

2.3 阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)患者神经元中HBP上调 炎症是AD的一个明确因素，因此识别确定导致神经炎症的分子并设计治疗防止免疫介导的神经毒性显得至关重要。除了具有抗菌活性外，HBP对小胶质细胞也具有趋化作用[19]，因此有研究者推测HBP介导与AD相关的神经炎症，并对此进行了试验以确定AD患者脑内HBP的来源，免疫组织化学技术显示HBP存在于AD患者颞叶和顶叶皮质神经元以及CA3和CA4海马神经元中，定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和western blotting也显示AD患者颞叶中HBP转录和蛋白含量增加，而这一区域正是受到AD高度影响的脑区，qRT-PCR同样证实了HBP在神经元中的表达，这些发现支持他们提出的神经元中HBP可以调节AD的神经炎性反应这一假设。值得关注的是在AD没有明显临床症状时HBP表达已经开始增加，HBP是否可以作为早期AD的生物标志物还有待进一步研究证明[20]。

2.4 HBP对平滑肌细胞功能的调控 动脉粥样硬化病变的主要细胞成分包括内皮细胞、平滑肌细胞和单核巨噬细胞，这些细胞间的相互作用促成了动脉粥样硬化病灶的形成[21]。由于HBP是一种有效的内皮细胞和单核细胞的激活剂，而这两种细胞正是参与动脉粥样硬化的重要细胞，因此有理由相信HBP与动脉粥样硬化有一定的联系。Lee等[22]在2002年就发现HBP存在于动脉粥样硬化病灶中。Gonzalez等[23]也对此展开了试验，探讨HBP是否对参与动脉粥样硬化的另一种重要细胞-平滑肌细胞有功能影响。对动脉粥样硬化病变部位染色以显示HBP和平滑肌细胞α肌动蛋白的存在，并测定粘附分子ICAM-1和VCAM-1，免疫组化结果显示HBP存在于动脉粥样硬化病灶的平滑肌细胞亚群中，但在正常的血管中不存在。采用流式细胞术双标记法对增殖标记物Ki-67和HBP进行标记，显示HBP主要表达于增殖的平滑肌细胞中，因此可以证明HBP在体外支持平滑肌细胞的迁移和增殖，此外与未处理的细胞相比，HBP处理过的平滑肌细胞ICAM-1的表达水平更高，不过令人不解的是，虽然VCAM-1被认为是促进单核细胞粘附的关键分子之一，HBP可以上调内皮细胞上的VCAM-1，但是此次试验并未发平滑肌上VCAM-1表达增加。鉴于HBP具有促进单核细胞和平滑肌细胞的迁移，单核细胞粘附内皮，上调内皮细胞和平滑肌细胞上的粘附分子，增强平滑肌细胞增殖能力，以及HBP在动脉粥样硬化斑块内的定位，可以推测其在动脉粥样硬化中发挥了重要作用。目前HBP作为炎性介质刺激内皮细胞、平滑肌细胞以及粘附细胞的迁移增殖的信号机制尚不清楚，或许HBP受体的发现才能揭开谜团，并且理解了这种分子机制及其受体的调节有可能为新疗法的发展提供有价值的参考。

2.5 急性细菌性脑膜炎的诊断标志物 急性细菌性脑膜炎(acute bacterial meningitis,ABM)是一种可危及生命或导致神经系统后遗症的感染性疾病，目前对于ABM的诊断仍然是一个不小的挑战，因为ABM与病毒性中枢神经系统感染在临床表现上常常难以区分[24]，因此会导致在细菌培养结果出来前对患者使用广谱抗生素，广谱抗生素的使用又反过来影响脑脊液革兰染色、血培养以及脑脊液培养的结果。而像脑脊液白细胞计数和乳酸、蛋白质、葡糖糖水平等也缺乏一定的鉴别力[25]。HBP是已经被证明的有抗菌活性的蛋白质，这一根据使得HBP成为鉴别中枢神经系统细菌感染的候选标志物。Linder等[26]研究了疑似脑膜炎患者的脑脊液HBP、乳酸、蛋白质、葡萄糖、中性粒细胞和单核细胞水平，结果表明，被诊断为急性细菌性脑膜炎患者的HBP水平(平均376 ng/ml)显著高于病毒性中枢神经系统感染患者(平均4.7 ng/ml)、神经性疏螺旋体病(平均3.6 ng/ml)和脑脊液细胞计数正常的对照组(平均3.5 ng/ml)。当HBP截断值为20 ng/ml 时，诊断ABM的敏感性和特异性分别达到了100%和99.2%，阳性预测值和阴性预测值分别为96.2%和100%，由此得出脑脊液HBP不单单可以作为诊断ABM的标志物，而且为区分ABM和其他中枢神经系统感染开辟了新思路。

2.6 休克和感染性休克患者血浆HBP水平变化 休克的发生是各种致炎因子以及抗炎因子作用于血管、细胞导致的微循环障碍，其中血管的收缩与扩张引起血容量的改变是休克发生的主要机制。研究已经证实HBP可作用于内皮细胞导致血管通透性的改变[10]，这就为HBP在休克患者中的应用提供了思路。有学者对感染性和非感染性休克患者血浆HBP水平进行了检测分析，并用局部感染但无休克症状的患者作为感染对照，结果发现健康对照组与局部感染患者血浆HBP水平并没有差异，而感染性休克和非感染性休克患者HBP水平显著高于对照组，但两者之间HBP水平也没有差异，因此可以说明休克患者血浆HBP水平确有升高[27]。另外Linder等[28]也发现重症脓毒症或感染性休克患者血浆HBP水平显著高于ICU中的非感染性疾病患者，并且HBP水平有疾病的严重程度有关，入院时HBP的升高与死亡风险增加有关，HBP水平的不断升高也是疾病预后恶化的迹象，因此不断监测ICU中严重感染患者血浆的HBP水平对疾病的治疗和判断预后有重大意义。

2.7 HBP与甲型H1N1流感的相关性 Kaukonen等[29]对ICU中的甲型H1N1患者进行了一项前瞻性研究，结果发现用PCR方法确诊的甲型H1N1流感患者的血浆HBP水平与正常血浆相比有明显的升高，并猜测HBP的增加与与呼吸功能障碍有关。 而ICU中的甲型H1N1流感患者常伴有肺炎、严重低氧性呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的发生，肺泡通透性增加导致肺泡内液体的积聚是ARDS发生发展的重要因素，HBP是感染时血管内皮细胞渗漏的诱导因子，因此有学者研究了ARDS患者血浆HBP水平，结果表明在ICU入院时血浆高浓度的HBP水平与ARDS患者呼吸和循环衰竭有关，并且与30 d死亡率相关[30]。

2.8 作为囊性纤维化的潜在标志物 囊性纤维化与细菌的肺部感染和中性粒细胞为主的气道炎症有关，Hovold等[31]进行了一项评价中性粒细胞来源的HBP作为气道炎症和细菌负荷的潜在痰液标志物的研究，将痰液HBP、中性粒细胞弹性蛋白酶和总细菌负荷与肺功能参数和气道症状进行比较，结果显示与正常的肺功能相比，HBP和中性粒细胞弹性蛋白酶与FEV1%的下降有关，而细菌负荷与此无关，并且当FEV1下降10%时ROC曲线下面积HBP为0.80、中性粒细胞弹性蛋白酶为0.78、细菌负荷为0.50，因此痰液HBP有希望成为囊性纤维化患儿气道炎症和肺功能的标志物，成为临床实践中一种简单互补的工具。

2.9 在其他疾病中的应用 随着研究的进展，HBP发挥其功能价值的方面也日益广泛。Nunes等[32,33]利用聚类分析、基因本体论分析、富集分析等方法建立并分析了来源于HBPs mRNA推测性表达的蛋白质网络，以此研究HBP网络在正常胰腺和胰腺消化系统疾病中的作用，结果显示胰腺细胞外推测性HBP比非肝素结合蛋白物有更好的相关性，正常胰腺(0.273)、急性胰腺炎(0.457)、慢性胰腺炎(0.329)、胰腺癌(0.269)的聚类系数较高。Griffith等[34]发现HBP是角膜上皮细胞迁移的重要调节因子，并通过PKCδ介导其作用。之后又利用动物模型发现HBP可以促进小鼠角膜伤口的愈合[35]。Dhaifalah等[36]在研究孕早期孕妇血清中HBP水平与自发性早产、早产儿胎膜破裂、医源性早产的可能相关性时发现与正常对照相比孕早期母体血清中低水平的HBP与早产儿胎膜破裂具有相关性。另外Tverring等[37,38]发现HBP能提高脓毒症相关的急性肾损伤的预测。

2.10 HBP与其他炎性指标的比较 HBP的发现打开了感染性疾病预测的另一扇门，许多研究都已证实HBP作为新兴的感染性疾病标志物在感染的早期发现和预测上与传统的、公认的炎性指标(如CRP、降钙素原、白细胞介素类、乳酸、白细胞计数等)相比豪不逊色，因其产生早，特异性好等特点又展现了与其他炎性指标相比具有的独特优越性，也是区分细菌感染和病毒感染较好的指标[39,40]。CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白，但是CRP值的升高滞后于炎症活动变化12 h左右，而且对感染的诊断缺乏特异性，除感染之外，心血管疾病、发热、关节炎、恶性肿瘤、结缔组织病等都会引起CRP值的升高。降钙素原(PCT)反映全身炎性反应的活跃程度，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高，而局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高，因此PCT不适用于局部感染的诊断。白细胞、中性粒细胞、乳酸等指标在非感染因素条件下也会升高，对感染诊断的准确性不高[41-43]。因此随着研究的深入，HBP进入实验室并应用于临床势在必行。

随着研究的进展，HBP在感染性疾病中应用的重要性日益增加，特别是在脓毒症患者的早期诊断和疗效监测中优势尤为明显，然而HBP的功能不止于此，在宿主免疫防御和免疫调节中HBP也显现出了其独特的功能。组织损伤或感染后，HBP在PMN外渗级联过程中通过细胞活化从PMN颗粒中释放出来，一旦释放，不仅发挥直接的抗菌作用还会激活APC，特别是HBP有助于单核细胞的募集和活化，导致细胞因子释放以及吞噬功能的增强，因此有学者甚至用免疫系统的“警报素”来形容HBP[44]。但HBP发挥其功能的分子机制尚不清楚，学者普遍认为的HBP受体尚未发现，体外重组HBP作为治疗干预作用的靶点有待证实，HBP的临床应用还需进一步的研究。