GPC3在肝细胞癌发生中的作用机制研究进展

叶婵琦 李琼 单建贞 阮健

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，以亚洲和非洲高发。近年来西方发达国家的HCC发病率也呈上升趋势，尤其是美国和加拿大[1]。我国是世界上HCC高发地区之一，每年发病人数约为30万，年病死率为20.40/10万，其中城市为19.98/10万，农村为23.59/10万，分别居恶性肿瘤病死率的第二位和第一位[2]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3）是一种细胞表面蛋白多糖，含有与核心蛋白相连的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）链。GPC3在70%的HCC中高表达，但在正常成人组织中不表达，与HCC患者的预后不良相关[3-4]。Wnt信号在胚胎发育和组织稳态中至关重要。在成人中，Wnt信号通路可以促进组织更新和再生，并与肿瘤的发生、发展密切相关[5]。多项研究表明GPC3的表达通过Wnt信号通路调控肿瘤的增殖和转移[6]。

由于GPC3在Wnt及YAP和Hh等多种信号级联反应中的重要性，GPC3可能作为生物标志物和免疫治疗中的有效治疗靶点在HCC的治疗中发挥关键作用[7-8]，因此我们对GPC3在HCC中的作用机制及相关进展进行了总结。

1 GPC3的结构及功能

GPC属于肝素硫酸蛋白多糖家族，由一个核心蛋白和两条HS糖胺聚糖链组成，通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定驻留在细胞膜外，是介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间相互作用的主要部分[9]。GPC的大小在60～70 kDa，其N端有分泌信号肽，C端为GPI锚。所有的GPC都存在14个保守的半胱氨酸区域，可以形成二硫键连接N端和C端。这种独特结构使其具有储存和隔离细胞因子、趋化因子和生长因子等分子的能力[7]。GPC吸引这些分子，并在细胞外基质和细胞膜周围形成浓度梯度，允许识别不同阈值的受体。哺乳动物中，该家族包含GPC1～6共6个亚型。GPC3的HS链已被证明可以结合包括Wnt在内的分子，也有相关研究表明核心蛋白也可能参与结合Wnt作为一个共受体[10-12]。有研究在GPC3的N端发现了一个用于结合Wnt的富含半胱氨酸的区域，这为GPC3是一个调节HCC细胞中Wnt/βcatenin信号转导的Wnt共受体提供了证据[13]。GPC3通过HS链吸引和储存生长因子，并将Wnt识别为共受体，在HCC细胞中发挥细胞表面糖蛋白的作用，调节Wnt信号通路。

2 GPC3与信号通路

2.1 通过GPC3调节Wnt信号 Wnt通路在某些疾病中异常激活，包括肿瘤和代谢紊乱。经典的Wnt信号通路传递是一个β-catenin依赖的过程，由Wnt通过两个共受体结合产生，即G蛋白偶联受体Frizzled（FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）[14]。Wnt配体与 FZD 中含有Wnt结合域的胞外富含胱氨酸结构域结合，两者的相互作用促进FZD-LRP5/6受体复合物的形成[15]。FZD和LRP5/6构象的改变以及随后糖原合酶激酶3和酪蛋白激酶1的磷酸化促进轴蛋白（Axin）的招募，细胞质散乱蛋白（dishevelled，DVL）被招募并结合到FZD的C端尾部进而形成含有DVL、Axin和其他结合物的破坏复合体[16-18]。Axin抑制了β-catenin降解，从而使β-catenin在细胞质中积累，并向细胞核移动，驱使细胞增殖相关基因的转录[19]。由于Wnt信号对细胞分化和修复等多种功能至关重要，因此Wnt信号通路的异常可导致多种肿瘤的发生。

GPC3能在HCC中激活经典的Wnt信号通路，约95%的HCC存在Wnt/β-catenin异常[20]。在HCC细胞系中，GPC3过表达促进肿瘤细胞的增殖和生长，说明GPC3作为Wnt蛋白的共受体可以调节细胞表面信号转导[14]。GPC3和缺失HS链的突变体GPC3都能与Wnt形成复合物，表明该复合物是通过GPC3核心蛋白激活的。Wnt激活不需要HS链，而HS链可能对稳定FZD很重要[21]，这为GPC3和Wnt相互作用提供了初步的证据。有研究报道通过抗体阻断GPC3可以增强Hep3B等HCC细胞系Wnt3a/β-catenin信号活性。Gao等[6]分离出HS20抗体，通过结合HS链阻断Wnt3a/β-catenin信号通路，发现HS20抗体干扰GPC3与Wnt3a的结合，阻碍与FZD的结合，在HCC细胞系和内源性表达GPC3的细胞中抑制了Wnt/β-catenin信号转导。该研究还指出，HS20在分别接种Hep3B和HepG2细胞的裸鼠体内模型中具有较强的抗肿瘤活性[6]。另一项研究在Hep3B模型中证实了GPC3和Wnt的内源性相互作用[22]。致癌的人硫酸酯酶 2（sulfatase 2，SULF2）在60%以上的HCC患者中上调，并在哺乳动物细胞中具有6-O-脱硫酶活性，可以从HS链中释放Wnt，并与GPC3和Wnt形成复合物。此外，研究表明，HS的硫酸化可能在结合Wnt和其他生长因子方面发挥重要作用。为了了解Wnt在HS聚糖上结合基序的确切机制，Gao等[11]设计了一系列不同长度和硫酸化修饰的合成HS寡糖，研究发现，2-O和6-O硫酸化对Wnt结合至关重要，而3-O硫酸化可以增强Wnt结合，这为GPC3 HS链上的Wnt结合域提供了直接证据。上述实验数据合理地联系了GPC3、SULF2、Wnt和 FZD。然而，HS上精确的Wnt结合域在结构和功能上还有待研究证实。

通过使用HN3单结构域抗体，可以发现GPC3核心蛋白上有 Wnt结合结构域[12，23]。Gao 等[13]对 Wnt/GPC3进行建模，将位于GPC3的N端疏水槽内的关键残基苯丙氨酸41（F41）突变为F41E，发现其在HCC细胞和小鼠模型中对Wnt3a的识别具有重要作用。同时发现GPC3的核心蛋白和HS多糖链的两个主要部分都可以调节Wnt信号。在Wnt基因检测功能报告中，单独的GPC3过表达激活了Wnt信号，并可通过F41E突变而减弱，但不能通过消除HS链而减弱。有趣的是，GPC3和FZD共转染诱导了Wnt活性的协同激活。当GPC3的HS链被移除后，这种协同效应被终止，而F41E突变则不再有协同效应。该动态模型可以将GPC3表达与HCC疾病进展联系起来，低FZD和无GPC3代表正常肝脏，高GPC3和低FZD代表早期HCC，高FZD和高GPC3代表晚期HCC[24]。正常肝细胞中不存在GPC3，Wnt可在无GPC3协同的情况下独立激活FZD,保持Wnt/β-catenin的普通激活水平。在HCC中GPC3上调，GPC3作为Wnt共受体，通过位于GPC3 N端包含F41的富含半胱氨酸疏水槽吸引Wnt至细胞表面[25]。HCC细胞中GPC3含量进一步升高时，FZD富集形成Wnt/GPC3/FZD复合物，此时HS发挥稳定Wnt和FZD的桥梁作用，Wnt信号通路扩大激活。。

2.2 GPC3和Wnt参与YAP信号调控 早期在果蝇模型中的研究涉及Hippo信号通路，其在调节器官大小和发育中起着重要作用。在哺乳动物中，Hippo信号通路涉及两个主要激酶，正蛋白激酶1/2（mammalian sterile20-like kinase1/2，Mst1/2）和大肿瘤抑制基因（large tumor suppressor 1/2，Lats1/2）激酶，Lats1/2 使转录共激活因子YAP发生磷酸化而失活，失活的YAP下调其下游靶基因如Cyclin E、diap1和bantam等的表达。YAP已被证明是Hippo信号通路中起关键作用的核效应因子，而Hippo信号通路在哺乳动物中导致YAP失活的确切机制尚不清楚[26]。此外，在信号通路方面的最新进展表明，Hippo通路能够抑制肝脏过度生长和HCC的发展。YAP在调节细胞增殖、组织再生和肿瘤形成中起着至关重要的作用。研究表明GPC3和Wnt通过YAP建立了联系，但β-catenin和YAP的调节机制尚未明确。此外，在细胞质中，有证据表明YAP可以调节DVL[27]。在HCC组织中，YAP的表达较高，提示HCC进展与YAP表达呈正相关[28]。

Miao等[29]利用靶向GPC3的抗体发现HN3能有效抑制HCC细胞生长。在进一步探索HN3具体作用机制时，发现在经HN3处理的HCC细胞中磷酸化的YAP（p-YAP），即失活的YAP表达明显升高。此外，在接受HN3处理的HCC细胞中，YAP总水平是降低的。GPC3沉默导致肿瘤细胞增殖速度下降，重组YAP的重新导入能够阻止由于GPC3沉默引起的细胞凋亡。该结果与早期发现的GPC3在HCC细胞中调控YAP信号通路一致[23]。在HCC细胞中敲低YAP，肿瘤细胞增殖速度显著减慢。在随后的实验中，通过HN3-GPC3的结合阻断Wnt信号通路的同时也抑制了YAP的表达，提示Wnt可能参与了YAP信号的上游调控[12]。以上结果表明YAP参与调节HCC细胞的增殖，且GPC3可能是YAP的上游调控因子，这些工作将YAP与GPC3和Wnt合理地联系起来。

2.3 GPC3调节Hh信号 Hh信号通路在胚胎发育中起着决定性作用，参与细胞生长、分化和血管形成等。当Hh通路过度激活时，可导致肿瘤发生或转移，与多种肿瘤密切相关[30-31]。在探讨GPC3在HCC细胞中的生物学作用时，Wang等[32]发现GPC3通过Hh信号通路促进HepG2细胞增殖。在哺乳动物中有3种Hh配体，包括desert（Dhh），indian（Ihh）和sonic（Shh）。Hh信号传递受靶细胞膜上两种受体的控制，分别为12次跨膜蛋白 patched（Ptc）和 7 次跨膜蛋白 smoothened（Smo）。在正常情况下，Ptc抑制Smo蛋白活性，从而抑制下游通路，这时下游的胶质瘤相关癌基因同源蛋白（Gli）在蛋白酶体内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。当Ptc和Hh结合以后，解除对Smo的抑制作用，促使 Gli蛋白与蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）及一些未知因子与微管形成大分子复合物，使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。GPC3在细胞膜上能与Ptc竞争性结合Hh，当GPC3与Hh结合后能促发胞吞作用及复合物的降解。此外，GPC3与Hh结合后导致未结合的Ptc受体数目增加，从而加强了对Smo的抑制作用。因此，GPC3在Hh通路是起着负性调节作用的[14，33]。

总而言之，上述信号通路之间的确切联系尚不清楚，Wnt、YAP和 Hh通路的关键步骤可能通过GPC3进行连接，未来对GPC3的进一步研究将有助于加深对HCC发病机制的理解及推动新型抗肿瘤药物的研发。