甲基丙二酸尿症动物模型研究进展

郑亚蓓，陆相朋，郑 宏

1)河南中医药大学第一临床学院 郑州 450008 2)河南中医药大学第一附属医院儿科 郑州 450000

甲基丙二酸尿症(methylmalonic acidemia,MMA)又称甲基丙二酸血症，是由甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase apoenzyme,MCM)缺陷及其辅酶钴胺素代谢障碍导致中间代谢产物异常蓄积而引起的一种有机酸尿症，同时也是目前发病率较高的遗传代谢病之一[1]。经对我国北京、上海、山东、河南等地的新生儿筛查，MMA发病率分别为1∶26 000、1∶3 920、1∶11 160、1∶6 032[2]。MMA根据MCM酶缺陷类型分为完全缺陷(complete mutase deficiency,mut0)和部分缺陷(partial mutase deficiency,mut-)型。大部分突变主要影响MCM两个结构域，即N端底物CoA结合区和C端腺苷钴胺素结合区。底物结合区的突变多导致mut0型，而钴胺素结合区的突变多为mut-型。我国MMA患者中约60%为MMA合并高同型半胱氨酸血症，以cblC型更为多见[3]。MMA CHC是cblC的编码基因，此基因突变可导致腺苷钴胺素以及甲基钴胺素合成缺陷，MCM及甲硫氨酸合成酶活性下降，最终导致甲基丙二酸和同型半胱氨酸水平增高[4]。

MMA的临床表现个体差异较大，缺乏特异性，主要表现为神经系统损伤，多累及肝脏、心脏、肾脏、呼吸系统及造血系统等[5]。目前，MMA主要依靠药物治疗，以维生素B12、左旋肉碱和甜菜碱为主[1,6]。研究[7]发现，部分MMA患儿出生后即使得到及时、有效、规范的治疗，仍遗留有神经系统后遗症，严重影响患儿的生存质量，并且给社会、家庭带来沉重的经济和精神负担。如何有效改善MMA的预后是我们研究的目标和努力的方向。目前基于动物模型的MMA病理机制的研究多集中在中枢神经系统及肝肾系统，但具体发病机制仍不够明确。因此，建立合适的疾病动物模型是深入研究MMA的必要条件。国内外近年来建立了数种MMA动物模型，现将相关研究进展总结如下。

1 皮下注射甲基丙二酸构建MMA大鼠模型

皮下注射甲基丙二酸构建MMA大鼠模型，能够成功模拟持续高浓度的甲基丙二酸对幼鼠大脑内各种生化指标的影响以及神经系统的损伤。早在 1988年Wajner等[8]选用新生Wistar大鼠幼鼠，从出生后第5天至第28天，每天两次皮下注射甲基丙二酸(0.72～1.67 μmol/g)，建立MMA大鼠模型;进一步检测发现，模型幼鼠脑内突触数量减少，小脑中神经节苷脂N-乙酰神经氨酸浓度降低；该实验初步揭示了MMA儿童智力发育延迟的原因。Dutra等[9]采用此模型进行MMA幼鼠旷场行为学研究，模型幼鼠出现明显学习记忆障碍。Brusque等[10]观察到此模型幼鼠大脑中髓鞘含量和神经节苷脂浓度明显减少，血液和脑内甲基丙二酸浓度与MMA患者相当。Pettenuzzo等[11]的研究结果显示，模型幼鼠脑内自由基生成增加，发生炎症反应，幼鼠表现出学习障碍；抗氧化剂对MMA幼鼠的行为有明显改善作用。Ribeiro等[12]利用物体探索实验和高架+迷宫实验再次验证，长期皮下注射甲基丙二酸可降低大鼠空间识别能力，升高大脑皮层神经炎症因子(IL-1β、TNF-α)水平，以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和3-硝基酪氨酸(3-NT)水平；模型幼鼠血液中性粒细胞计数减少，单核细胞和其他类型细胞计数增加。Li等[13]发现，MMA模型大鼠海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO含量增加，丙二醛和iNOS浓度升高，小胶质细胞活性受抑，谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性降低，小胶质细胞的异常活化加重了海马神经元的凋亡；进一步明确氧化应激和炎症反应会加重MMA患者认知功能障碍，使用抗氧化剂(氨基胍)可以改善MMA患者的认知功能障碍。

综上所述，通过皮下注射甲基丙二酸制备的MMA模型大鼠可表现出神经系统损伤，包括脑神经结构损伤、脑神经发育损伤、认知及行为等脑功能改变和血液、脑脊液生化异常。此模型适用于神经系统后遗症新药物疗法的研究。

2 基因敲除MMA小鼠模型

单纯型MMA是由于编码MCM蛋白的MUT基因突变导致MCM蛋白活性降低而发病。基于人MUT基因与小鼠MUT基因位点的同源性，采用基因打靶技术从分子水平上删除某一基因、去除某一外显子、导入点突变或者用其他相近基因取代，可以获得相应疾病的动物模型。Peters等[14]利用基因打靶技术敲除C57BL/6小鼠含有第3外显子的关键CoA结合域内Mut等位基因，建立首个基因敲除MMA小鼠模型(简称KO小鼠)，即Mut-/-MMA小鼠模型。该模型小鼠体内检测不到MCM酶活性，与Mut-/-MMA患者的临床表现相似，出生后死亡率高，血、尿及组织中异常代谢产物水平显著增高，脏器结构和功能出现异常，线粒体损伤，发生炎症反应和氧化应激反应[15]。此后，Chandler等[16]又创建一个改进的Mut-/-小鼠模型，此模型小鼠的存活率高，小鼠体内既无Mut mRNA，也不产生MCM蛋白，甲基丙二酸循环代谢物水平明显升高。该模型为从分子水平深入研究MMA的病理生理学特征提供了便利。该模型小鼠神经系统、肝脏组织中可观察到与MMA患者相似的形态学和酶学改变，并伴有呼吸链功能障碍的巨线粒体形成，提示可以从改善线粒体功能和氧化应激方面入手，寻找MMA治疗的突破口。

Chandler等[17]将携带有Mut基因的腺病毒通过肝内注射的途径给予Mut-/-MMA小鼠，之后小鼠体内异常代谢物水平均有所降低，提示肝脏靶向基因治疗MMA有效，这为靶向肝细胞的基因和细胞疗法提供了实验基础。Chandler等[18-20]对Mut-/-MMA小鼠肝内注射重组腺病毒相关血清，小鼠存活时间延长，肝脏中可持续表达MCM。Wong等[21]采用病毒载体介导的基因疗法治疗Mut-/-MMA小鼠，小鼠体重接近正常，其肝脏中MCM显著表达，血、尿中甲基丙二酸水平降低。以上研究结果表明靶向治疗可以用于MMA。

3 转基因MMA小鼠模型

转基因模型的构建主要是利用DNA重组、转化等将特定的外源目的基因经显微注射转移到受体，并使之产生可预期的、定向的遗传学改变，使生物体正常发育。目前利用转基因技术构建MMA模型的方法如下。

Peters等[22]将携带有完整人MCM基因座的DNA克隆序列显微注射到已受精的C57BL/6小鼠卵母细胞核中，生育出转基因小鼠；新生小鼠经过进一步杂交繁殖，筛选出的小鼠表达完整的人MCM的水平不一；此模型小鼠转化MCM活性的能力较弱，大脑中MCM表达最高，其次是肾脏和肝脏。小鼠对于支链氨基酸的代谢途径不同于人类，转基因小鼠携带有人MCM基因，可以用于观察人MCM的表达，同时也适用于评估肝细胞移植、基因疗法及药物上调疾病基因表达效果的研究。Buck等[23]将携带有人终止密码子的突变基因经过转基因技术引入到Mut-/-MMA小鼠，并与其杂交产生没有内源性MCM、只有终止密码子的转基因小鼠；小鼠出生后24 h内死亡率高，血、尿中的异常代谢产物水平高，尤其是尿液中代谢产物水平高于血液，而且出现肝脏、肾脏肿大，该模型较适用于基因治疗方法的研究。

Forny等[24]利用胚胎干细胞靶向生成携带MCM错义突变等位基因的小鼠，经过一系列复杂过程而生成与临床相关的转基因Mut(Ki/Ki)小鼠和Mut(Ko/Ki)小鼠。两种小鼠的存活时间均明显延长，但生长仍比较缓慢。与Mut(Ki/Ki)小鼠相比较，Mut(Ko/Ki)小鼠MCM活性更低，代谢产物浓度更高。正常饮食时，Mut(Ko/Ki)小鼠会出现明显的肾脏和大脑损伤，肾脏和大脑损伤标志物Lcn2水平明显升高。钴胺素可治疗部分因饮食引起的Mut(Ki/Ki)小鼠的代谢危象，对同种情况的Mut(Ko/Ki)小鼠改善不明显。此类模型小鼠与人高度相似，因其存活时间长，更适用于对MMA慢性临床表现病理生理机制的研究。

Manoli等[25]利用转基因技术构建了在肝细胞中表达Mut基因的Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠模型。此类小鼠新生儿期存活时间延长，代谢产物增加；高蛋白饮食后肾小球滤过率降低，慢性肾小管间质肾炎、肾小管功能不全的近端小管线粒体超微结构显著改变；近端肾小管细胞色素C氧化酶(COX)活性降低，电镜下可见肾小管胞质中多种基质颗粒/沉积物增多。抗氧化剂能有效改善高蛋白饮食引起的Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠肾功能不全现象。Mut-/-；TgIns-Alb-Mut小鼠的基因组学和生化特征检测结果显示，超过50多种生物标记物与MMA患者相似。该模型适用于探索与线粒体功能障碍机制有关的MMA肾脏病理研究。

Manoli等[26]再次利用转基因技术构建在骨骼肌中表达Mut基因的Mut-/-；TgIns-MCK-Mut小鼠模型。该模型小鼠存活率有所提高，但生长迟缓并伴随肝、肾细胞线粒体病变，仍需补充高脂肪食物和碳水化合物( high-fat and carbohydrate，HFCD)才能生存；血清中甲基丙二酸及Lcn2浓度显著升高，COX缺乏，碱性磷酸酶浓度升高，淀粉酶浓度降低；肝细胞胞质中有明亮的Mallory小体及大量嗜酸性空泡，电镜下可见肝细胞内线粒体增大，嵴缩短或无嵴，与人类病理改变非常相似；空腹状态下，起着重要代谢调节作用的Fgf21因子浓度明显升高，伴发肝细胞线粒体功能障碍以及各种急慢性应激反应，并首次提出Fgf21因子是反映MMA肝脏病变严重程度的生物标记物。该模型小鼠经腺病毒肝脏靶向治疗，临床和生化特征均有所改善。

针对不同突变类型，特别是我国人群c.609G>A热点突变，开发出不同的动物模型是未来基因治疗的研究方向。马飞等[27]应用高效基因编辑工具成功构建了W203X纯合突变cblC型MMA小鼠模型。此模型小鼠生后12 h内血代谢物水平正常，24 h后血代谢物C3水平显著升高，整体存活时间较KO小鼠明显延长，成功复制了重症cblC型MMA患儿的临床表型，为生后早期实施基因治疗提供了时间窗。

4 总结

MMA是多基因突变导致的遗传性疾病，发病机制复杂。生物化学药物诱发的MMA模型具有构建简单、易于操作的优点，是比较经典的MMA动物模型构建方法，但该类模型虽能成功模拟人体组织及体液中甲基丙二酸水平的升高和行为学改变的特征，却不能完全复制MMA患者的临床特征。为此，基因敲除模型在某种程度上更能解释多种异常代谢物所导致的MMA。基因敲除MMA小鼠模型能够从生化和表型方面成功模拟人体体液和组织中代谢物含量升高，生长发育缓慢等表现；其缺陷是KO小鼠不含MCM基因，死亡率高，不能在基因型和表型水平上显示关键特征，不适用于旨在增加MCM活性的治疗方法的研究。而转基因小鼠模型恰好可以弥补基因敲除小鼠MCM缺陷的问题，但是转基因小鼠模型制备过程中，显微注射外源DNA很容易造成插入突变，极不稳定。目前CRISPR/Cas9技术广泛应用于疾病动物模型构建等领域，也将成为MMA动物模型研究的新方法。