松弛素家族及其受体在精子发生过程中的作用研究进展

董盼攀 杨凯 张天宇 曾庆琪

松弛素（relaxin，RLN）是 1926年由 Dr.Frederick Hisaw在地鼠和豚鼠的性腺激素中发现并命名的一种短循环多肽激素，在妊娠、分娩及其他女性生殖方面起重要作用。人类RLN家族多肽包括RLN1、RLN2、RLN3和类胰岛素多肽（insulin like peptides，INSL）3、INSL4、INSL5、INSL6两大类。成熟的多肽由二硫键连接的A、B两条肽链组成，其中B链有些氨基酸残基是RLN分子受体识别位点的重要部分。不同物种RLN的结构、生物学作用差异很大[1]。随着研究的不断深入，有学者发现RLN对非生殖系统起到抗纤维化、舒张血管以及促进组织愈合等作用[2-3]。自从2007年Agoulnik[4]在精液中发现RLN家族及其受体，其在男性生殖领域也成为了研究的热点，但作用仍存在争议。本文就RLN家族及其受体在精子发生过程中的作用及可能的机制作一综述。

1 RLN家族及其受体分布

人类的RLN基因从cDNA数据库中分离，并通过质谱法进行鉴定。在灵长目动物中，RLN通过复制，产生了RLN1和RLN2。RLN2是生物进化过程中RLN1的直系同源基因，两者分子结构非常接近，仅13个氨基酸序列排列有别，其中RLN2是组织储存及血液中存在的主要形式。卵巢和前列腺是RLN2的主要来源[5]。早在1998年，Steinetz等研究提出，RLN3是所有RLN家族最原始的多肽，但目前大多研究认为RLN3是一种神经肽，主要参与摄食调节、压力、记忆等脑部的神经调节[6]。RLN3复制以后产生INSL5。与RLN3一样，INSL5维持非性腺表达模式，主要参与胃肠道调节。INSL4和INSL6与两性和mab3相关转录因子1（doublesex-mab3-related transcription factor1，DMRT1）基因紧密连锁，参与脊椎动物古老的性别决定，在生殖功能中发挥作用[7]。

RLN受体是G蛋白偶联受体，也称为RLN家族肽受体（receptors for relaxin and related peptides，RXFP）。胰岛素RLN肽类激素家族的进化还伴随着使用的受体的连续变化。RLN是RXFP1的内源性配体，RXFP1与RLN的亲和力是RXFP2的5倍。RXFP2也是INSL3的受体。当RLN3复制产生INSL5时，受体也从RXFP3复制成为RXFP4。这两种受体主要与磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）和 Ca2+细胞内信号通路相关[8-9]。截止目前，INSL4、INSL6的受体尚未见相关报道[10]。

2 RLN家族对精子发生的影响

RLN家族及其受体在不同组织的共表达提示RLN可能存在自分泌和旁分泌作用。虽然目前已有研究表明男性生殖系统存在部分RLN家族及其受体，但其对精子的发生及作用过程尚未十分明确[11]。Pimenta等[12]通过培养大鼠睾丸细胞发现，与对照组相比，RLN对生殖细胞群体的比例没有影响，但增加了未分化和分化的精原细胞标记早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF）、c-kit和减数分裂后标记外密纤维蛋白 2（outer dense fiber protein 2，Odf2）在D5的基因和（或）蛋白的表达。用小干扰RNA敲除RLN可减少β-catenin在细胞连接处的表达，并将其表达转移到细胞核，由此认为RLN可能通过调节精原细胞的自我更新和促进细胞接触来影响精子发生。Feugang等[13]研究发现RLN主要聚集在睾丸的间质细胞中，在前列腺和精囊中含量较低；在曲细精管和附睾的管腔和上皮中也发现RLN表达；精子本身也存在RLN，且集中在顶体区，RXFP2比RXFP1分布更均匀。Braun等[14]报道RLN与RXFP1一起参与精子发生的第一阶段，而RLN3通过与RXFP3结合参与了生精过程。此外，还观察到 RLN、RLN3、RXFP1、RXFP2 和 RXFP3 mRNA的表达与睾丸中单倍体细胞的相对数量呈正相关。INSL3在睾丸各发育阶段均有高表达。由于其受体RXFP2的低表达和非阶段依赖性，INSL3在精子发生过程中不太可能具有自分泌和（或）旁分泌功能。在成人睾丸中，RLN、RXFP1和RXFP3的mRNA主要在睾丸管状室表达，而INSL3在间质细胞表达较多。Heidari等[15]则通过不同剂量的RLN3培养正常的精液标本，发现RLN3可以减缓精子活力的自然下降，但没有检测到RXFP3 mRNA在精子中的表达，提示RXFP3在精子发生过程中停止表达。Yeganeh等[16]通过免疫荧光和RTPCR法，首次证实了RXFP4在精子中的存在，且集中分布在颈部和中段。INSL5则能抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）对线粒体的损伤，从而影响精子的发生、运动等。而目前INSL4只在胎盘上表达，在男性任何生殖道部位都未检测到。Burnicka-Turek等[17]通过基因敲除小鼠研究表明，INSL6基因缺失的小鼠表现出明显的精子发生中断和减数分裂停滞，且INSL6在保护生殖细胞免受凋亡方面具有作用。

3 RLN对精子发生的作用机制

RLN介导多种生物学作用，包括纤维化、扩张血管、促血管生成、抗炎、抗凋亡和器官保护等作用[18]。在细胞水平上，RLN与受体RXFP1相结合，激活多种下游信号转导通路。RLN通过复杂多样的信号转导机制在机体中发挥其多样的生物学效应，包括环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途径、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、蛋白激酶（protein kinase C，PKC）途径和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）途径等。不同的细胞间，RLN诱导的信号转导机制不完全相同[19]。在Sertoli细胞中，RLN主要通过ERK1/2及 PI3K/蛋白激酶 B（protein kinase，Akt）这两条通路对精子发生产生影响。

3.1 PI3K/Akt及ERK1/2信号通路 PI3K/Akt信号通路参与细胞周期的调节，包括介导细胞存活、凋亡和增殖。McGuane等[20]通过使用PI3K抑制剂Y294002发现，通过RXFP1介导可快速激活PI3K的下游Akt。ERK1/2是MAPK家族成员，参与调节一系列细胞生物学过程，如细胞增殖和分化等。Nascimento等[21]研究发现，在大鼠原代培养Sertoli细胞中，RLN能在5～10 min内诱导ERK1/2快速磷酸化，在30 min内恢复到基础水平。外源性RLN可增加Sertoli细胞数量和增殖细胞核抗原的表达。在大鼠Sertoli细胞中，丝裂素活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制剂U0126阻断了RLN引起Akt磷酸化的能力，而抑制PI3K则削弱了RLN治疗增加ERK1/2磷酸化的能力。由此可见，ERK1/2和PI3K/Akt通路之间似乎也存在串扰。

3.2 促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）和RLN的相互作用 Sertoli细胞功能受多种激素调节，如FSH能调节其增殖及协助细胞间通讯，且有助其形成血-睾屏障。Soffientini等[22]研究表明FSH在决定啮齿动物体内支持细胞增殖和细胞数量方面起着重要作用。FSH促进未成熟大鼠Sertoli细胞ERK1/2磷酸化和增殖，但在Sertoli细胞分化开始时抑制MAPK通路。一方面，PI3K/Akt/哺乳动物靶点雷帕霉素复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路也参与了FSH诱导的人髓细胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene，c-Myc）表达和 Sertoli细胞增殖，另一方面腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的激活可能通过降低mTORC1活性和增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases-1，CDK1）的表达而参与抑制Sertoli细胞的增殖[23-24]。然而，Nascimento等[25]通过研究FSH和RLN对15日龄大鼠Sertoli细胞增殖和分化相关的细胞内信号通路的影响发现，在支持细胞发育的这个时期，FSH通过激活c-AMP/环磷腺苷效应元件结合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB），抑制ERK1/2和Akt通路，进而引导细胞分化。RLN通过抑制 cAMP和激活 ERK1/2、Akt、NF-κB来拮抗促性腺激素信号转导，但不阻断促性腺激素诱导的分化过程。

4 结语

Sertoli细胞在生精过程中的重要程度不言而喻。综述RLN家族及其受体对Sertoli细胞功能调节的研究进展，为后续进一步实验研究作用分子机制及临床治疗生精障碍提供了新思路。