甲状腺髓样癌分子生物学研究及基因靶向治疗临床应用进展

孙思涵 张煜 罗定存

甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）是一种起源于滤泡旁C细胞的恶性肿瘤，约占所有甲状腺癌的5%～10%。它以散发型为主，仅20%～30%是遗传型[1]。遗传型MTC多出现在2型多发内分泌肿瘤（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2）的患者中[2]。MEN2 包括 MEN2A、MEN2B、家族性 MTC（FMTC）[2]。MEN2A以MTC、嗜铬细胞瘤及原发性甲状旁腺功能亢进为主要特征；MEN2B通常不出现原发性甲状旁腺功能亢进；FMTC以MTC为唯一特征[3]。本文就近年来MTC分子生物学研究及基因靶向治疗临床应用进展作一综述，以期为MTC的诊断与治疗提供新思路。

1 MTC的诊疗现状

与甲状腺乳头状癌、滤泡状癌相比，MTC发病率低但恶性程度高，生长缓慢但呈浸润性，可侵犯甲状腺外的颈部及纵隔组织器官，整体预后更差，病死率高[4]。目前影像学检查难以早期诊断MTC，细胞学检查存在假阳性的可能，一些肿瘤标志物检测虽然较为灵敏，但对MTC的诊治是否有指导性意义仍需进一步研究明确[5]。MTC治疗以手术为主，但在手术方式及淋巴结清扫范围方面仍缺乏共识，而且术后易复发，复发后唯一有效的治疗手段还是手术。相关研究结果显示，接受外科治疗的MTC患者再次手术率为16.3%，甚至更高达37%[6]。患者多次手术易发生喉返神经及甲状旁腺损伤，手术致残率升高。

MTC的早期诊断尚缺乏特异性基因标志物。近年来出现的基因分子水平诊断方法以灵敏度、特异度较高被广泛用于各类疾病的早期诊断，可能在MTC中也有一定的应用前景。在治疗方面，目前尚无有效且被广泛认可的治疗方案，而MTC的挽救性保守治疗在提高患者生存质量方面可能有一定的优势。

2 MTC相关基因

2.1 转染重排（rearranged during transfection，RET）基因

2.1.1 RET简介 原癌基因RET由第10号染色体上的21个外显子组成，编码一个属于酪氨酸激酶受体超家族的跨膜蛋白。RET蛋白包含一个富含半胱氨酸的胞外区域，其胞内区域含有2个酪氨酸激酶结构域（TK1、TK2）[1]，通过激活大鼠肉瘤病毒致癌基因同源突变（ratsarcoma viral oncogene homolog，RAS）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）等通路，参与细胞生长、增殖及分化信号传导，并对促凋亡转录因子——激活转录因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）有抑制作用[1，7]。

2.1.2 RET常见变异类型及致病机制 约98%的遗传型MTC有生殖细胞RET突变，位于第10外显子（609、611、618、620密码子）和第11外显子（634密码子）的突变最常见[1]。超过90%的MEN2A和80%的FMTC存在密码子611、618、620和634错义突变。上述突变使半胱氨酸富集域内半胱氨酸被替代，导致组成性二聚化和活化。约95%的MEN2B患者在外显子16存在M918T突变，使得胞内TK2结合位点的构象发生变化，导致蛋白质的自磷酸化并激活RET受体。M918T突变可影响死亡受体介导的体外细胞凋亡途径，从而参与肿瘤的发生、发展[1]。

近50%的散发型MTC中存在体细胞RET突变，其中在25%～33%的患者中可以检测到体细胞RET基因918 密码子突变[8]，其他的 618、634、768、804 和 883密码子突变以及RET基因部分缺失也有文献报道[1]。国内研究结果显示，新型S409Y突变也可能具有致病性[9]。在RET突变的散发病例中，除了单点突变患者，还存在包括G911D、M918T和E921K三重体细胞突变以及V591I+M918T双重体细胞突变的患者[1]。在大多数可检测到M918T突变的散发型MTC患者中，变异仅存在于肿瘤的一部分而不是整个肿瘤。在多发性、转移性的散发型MTC患者中，同一个患者的不同病灶可能分别包括了M918T突变及A883P突变[10]。这些发现意味着RET突变可能不是导致散发型MTC发生、早期发展中的必需事件。可见，相较于遗传型MTC，RET突变阳性的散发型MTC分子机制更复杂多样，而目前尚未建立全面的体系。

2.1.3 RET与MTC临床特征 不同类型的RET突变可影响MTC的生物学行为及临床特征。在MEN2B患者中，M918T突变最为常见，与特别早期的侵袭和转移行为有关[1]。对中国人群MEN2A家系中119个家系成员的横断面研究结果显示，RET突变仅限于C634R，且与最早发病有关，通常发生在20岁之前；此外，与MEN2A特别早期的侵袭、转移行为以及肾上腺嗜铬细胞瘤、原发性甲状旁腺功能亢进相关[11]。另一项对波兰人群的研究发现，第10外显子突变最为常见，突变频率为38.8%，而密码子634的突变频率为26.8%[12]。这与多数基于中国人群的研究结果并不一致。

同样的，体细胞RET突变可导致散发型MTC扩散、复发、远处转移的风险增加，而且可能与淋巴结转移及死亡风险增加相关[13]。研究表明，RET基因中多个多态性等位基因的存在可能与MTC的发展和侵袭风险有关，但关于法国、土耳其等国家发病人群的研究并不支持这样的结论。这可能与不同国家人群潜在的遗传背景差异有关。关于RET多态性等位基因协同效应的发生机制，学者们提出了2种假说，一个假设是多态性可能影响RET mRNA表达，但是关于具或不具有S836S多态性患者的MTC肿瘤组织中mRNA表达的定量研究中未显示出差异；另一个假设是DNA分子中的碱基交换可以产生新的选择性剪接位点，导致截短蛋白质的合成、错误的配体结合、微小 RNA（micro RNA，miRNA）结合、mRNA结构和稳定性的改变以及许多拷贝，还有翻译干扰引起的蛋白质结构变化[14]。由于对应上述假说的验证性试验较少，仍需要更大样本研究来进一步证实。

2.1.4 RET与临床应用 上文提及的MEN2A及MEN2B中常见的突变类型在过去研究中已被多次验证，而最新研究结果却因研究人群不同产生了差异，且在散发型MTC多态性等位基因的协同效应研究中也存在同样的矛盾结论。笔者认为这意味着存在RET突变的MTC患者在临床特征上可能存在地区差异，在未来临床挽救性保守治疗上可能需要实现地域个体化。此外，RET M918T、C634R突变均与遗传型MTC特别早期的侵袭和转移行为有关。事实上，遗传型MTC为家族群聚发病，若能实现对上述基因的早期筛查，可能对遗传型MTC的评估与预后具有较大的指导意义。在实际临床工作中，多数MTC患者为散发型；因此完善上述散发型MTC基因协同效应的研究，有助于推动临床上RET基因筛查结果在评估发病风险或疾病预后中的应用进程。

2.2 RAS基因

2.2.1 RAS简介 约2%～5%的MEN2家族没有RET突变。许多散发型MTC患者不携带RET突变，即可能存在其他导致MTC的基因突变。事实上，研究发现某些MTC还涉及RAS基因突变[1]。RAS基因家族编码3种同源异构体（NRAS、HRAS和KRAS）及21-kDa膜相关蛋白，在从受体（酪氨酸激酶、耦合G蛋白）到腺苷酸环化酶（MAPK、PI3K/Akt）途径的信号传导中起一定作用，并受结合了RAS的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）的水解过程调节（由GTP介导）[15]。

2.2.2 RAS常见变异类型 研究表明，RAS突变存在于69.2%（18/26）的RET突变阴性的患者中；而在40例RET阳性散发型MTC患者中，仅1例检测到RAS突变[1]。该研究推测在散发型MTC患者中RET突变与RAS突变事件可能是2种不同致癌途径。此外，学者发现在RET阴性散发型MTC患者中，HRAS突变占56%，KRAS突变占 12%，NRAS突变占 0%～1.8%[1]。HRASQ61R是MTC中常见的体细胞RAS突变，免疫组化中可见特异性表现，这有助于散发型MTC的诊断[16]。

2.2.3 RAS与MTC发病机制 RAS突变可增加GTP亲和力或抑制自动催化GTP酶，这2种机制导致MAPK和PI3K/PKB信号传导途径的不正确激活，从而影响MTC的发生、发展进程[1]。RAS相关的癌性增殖有2种主要激活途径：MAPK和PI3Kα/PKB/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[17]。实验发现RAS突变与更高强度的磷酸化S6核糖体蛋白（mTOR的下游效应因子）表达显著相关，在散发型MTC患者中可观察到磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）（即 mTOR 抑制剂）在胞质中的表达明显降低[18]。这些结果揭示了mTOR途径的活化与MTC中RAS突变是否存在有关，但具体分子机制尚不清楚。

2.3 其他基因 多重肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor 1，MTS1）BRAF、CDKN2 以及 PI3KCA 等其他基因也可能参与MTC的发生、发展过程。BRAF与RET、RAS一样，参与了丝裂原激活的蛋白激酶途径。一项研究报道了散发型MTC患者BRAF V600E突变率很高，但之后的研究结论与该文献并不一致。这可能由于样本太小或人种差异所致，因此需要进一步研究证实。有学者将BRAF、CDKN2A和PI3KCA突变列为MTC肿瘤发生过程中的辅助条件，这些基因可直接参与肿瘤发生的调节[19]。其他被提及的还包括作为调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、代谢和血管生成的中心枢纽的PKB，PKB失调可能增强RET突变的致MTC途径。综上，在MTC的治疗中，作用于1个或多个位点靶向途径的特异性抑制剂可能成为优势药物。

此外，在MTC中有多个异常表达的miRNA被发现。最早有研究报道了在MTC中发现有4个miRNA过表达及6个miRNA低表达。后续又发现miR-127、miR-154、miR-224、miR-323、miR-370、miR-183、miR-375和miR-9在MTC中过表达[1]。一项对34例MTC患者的研究发现，miR-224低表达的肿瘤患者总体存活率明显低于高表达者[20]。同样研究表明miR-375高表达与MTC患者总体生存率显著降低相关，miR-375有望成为晚期预后的标志物[21]。另有研究发现，有关miRNA生成的基因所编码的mRNA在RET突变阳性MTC患者中过表达[1]，这表明参与miRNA生物合成的基因也可能成为RET突变阳性MTC的治疗靶点。由于miRNA在甲状腺癌发生过程中失调的生物学作用尚不清楚，因此MTC中miRNA的价值需要更多数据作进一步评估。

3 MTC的挽救性保守治疗

3.1 RET相关靶向药物 其他恶性肿瘤中针对RAS突变的靶向药物研究进展并不顺利，故MTC挽救性保守治疗的热点在于RET突变MTC的靶向治疗。临床试验中评估了几种小分子多激酶抑制剂，其中凡德他尼和卡博替尼已获得批准用于MTC治疗。在Ⅲ期试验中，上述两者均未达到至少50%的客观缓解率[22]。使用上述2种药物的治疗过程中，可能出现高血压、出血或穿孔及腹泻等胃肠系统问题、皮肤病、甲状腺功能减退等药物毒副反应，有些毒副反应甚至危及生命[23]。此外，安罗替尼在Ⅰ期临床研究中的抗肿瘤作用较好；而国内Ⅱ期试验评估了安罗替尼在晚期MTC治疗中的有效性，其毒副反应较上述2种药物小而可控，具有治疗晚期MTC的潜力[24]。对于RET抑制剂，最新研究表明当突变的影响位于RET激酶活性位点以外（如M918T、E768D、L790F、Y791F、A883F）时，RET 抑制剂（如凡德他尼）有明显的治疗效果，当突变影响位于酶活性位点内（如V804L、V804M），大多数抑制剂无明显效果。笔者认为这个发现可以用来解释凡德他尼、卡博替尼的Ⅲ期试验中客观缓解率较低以及部分患者对这2种药物产生耐药的原因。针对这些特殊突变，一类新型杂环化合物5-（4-氯苯基）-3[（4-氯苯基硫代）甲基]-1氢-1，2，4-苯三唑即化合物5可抑制目标蛋白活性，此外新发现的1，2，4-苯三唑衍生物5可有效抑制散发型RET突变型及V804L突变型MTC。笔者认为上述化合物有望克服凡德他尼、卡博替尼应用过程中存在的耐药问题[25]。此外，新一代RET抑制剂BLU-667已被报道，在疗效和毒副反应方面均有显著改善的作用[26]，但其在MTC的疗效是否优于凡德他尼等药物则需要进一步研究来证实。在密码子634突变型的遗传型MTC患者中，其受体的配体非依赖性二聚化和自磷酸化在还原条件下可以逆转，据此推测如果有药物能有效逆转上述变化，则该药可用于存在遗传突变家系的MTC的保守治疗。

3.2 其他相关靶向药物 实验证明，表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）及血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）等多个参与致癌途径的受体在MTC患者中上调。抗EGFR抗体和小分子抑制剂在体内外均表现出对RET突变的散发性MTC和FMTC有抗增殖作用，上述2种物质均为EGFR的受体激酶活性抑制剂[13]；从而推测一些EFGR靶向药如酪氨酸激酶抑制剂（吉非替尼、埃罗替尼）及单克隆抗体（西妥昔单抗）等有望成为治疗MTC的药物，但具体机制及临床效果有待进一步探究。已有实验证明，mTOR通路在MTC中被激活，在种系RET突变的情况下优先表达[1]。实际上与mTOR通路相关的靶向药物联合应用，如多受体靶向生长抑素类似物帕瑞肽以及mTOR抑制剂依维莫司，被证实可能起到减缓MTC进展的作用[27]。

3.3 药物联合使用 除了上述单一用药外，关于MTC联合用药方案的研究也取得了新进展。研究证明，内质网相关蛋白降解抑制剂（如依阿司他汀）与舒尼替尼或凡德他尼联用，可协同诱导ATF4高表达，导致肿瘤细胞凋亡增加，而对正常细胞的影响较小[28]。然而目前该种联合用药的研究还未进行到临床阶段，故需要更多临床研究来验证有效性。在小鼠实验中发现，miR-153-3p可增强卡博替尼对MTC细胞生长的抑制作用，其作用机制是抑制了mTOR信号通路[29]。可见，联合用药能相对减少RET抑制剂的用量，从而降低毒副反应发生率，这可能成为未来MTC最具潜力的挽救性保守治疗方案之一。

MTC挽救性保守治疗待解决的问题还很多，比如各种靶向药物的毒副反应、抑制EGFR使各组织中内皮细胞凋亡、微血管退化致功能障碍等。当前总体上发现了一些新治疗靶标，但许多具有治疗潜力的药物仍需要通过临床试验来验证，更多治疗性干预新方案等待被发掘。

4 总结

近年来，在MTC的分子发病机制研究方面取得了进展，RET原癌基因已作为遗传型MTC的易感基因，相关基因筛查可为预防性甲状腺切除提供诊断依据。但在散发型MTC中，遗传突变和分子改变尚未完全确立。尽管RAS基因的点突变、非编码miRNA的异常表达和一些其他肿瘤发生相关的基因（BRAF、Akt、CDKN2A、PI3KCA）列入研究，以期用于靶向治疗，但是关于发病机制及MTC发生过程中涉及的遗传缺陷和细胞信号传导途径改变等细节仍需要进一步研究明确。综上，寻找特定基因作为MTC挽救性保守治疗和预测预后的分子指标、明确治疗靶点及治疗药物是当前MTC研究的新内容和重要方向。