5-HT 对形觉剥夺成年大鼠视皮层神经传递的影响

□王娇娇 许锦秀 刘向玲 许彤（.新乡医学院三全学院 河南 新乡 453003；.新乡医学院第二附属医院 河南 新乡 45300）

弱视是指视觉发育敏感期内不正常的形觉体验造成的视力障碍，Maya 等人研究发现成年弱视大鼠长期应用氟西汀，可明显逆转眼优势柱转移和促进视功能恢复，但其作用机制不明，而这对成人弱视的治疗至关重要。因此， 本研究以长时程增强（long-term potentiation，LTP）为研究指标，拟用电生理学方法探讨5-羟色胺盐酸盐对单眼形觉剥夺性成年弱视大鼠离体脑片视皮层LTP 的影响，观察5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在成年弱视大鼠双侧视皮层神经传递中的作用， 为临床治疗成人弱视提供一定理论依据。

1、材料和方法

1.1、材料

5-羟色胺盐酸盐（美国Sigma 公司）；LEICA VT 1000S 振动切片机（美国Leica 公司）；MODEL-97 拉直仪（美国Sutter Instrument 公司）；Micro1401 数模转换器、Hum bug 电噪音消除器（英国Digitimer 有限公司）；PZMTIII-BS 精密立体变倍显微镜（美国WPI公司）；MINIPULS-3 蠕动泵（美国GILSON 公司）；Master-9 脉冲刺激器（以色列AMPI 公司）等。

1.2、方法

（1）实验动物及分组。

2 周龄SD 大鼠16 只，标准清洁级，眼部无疾患，雌雄不限，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司， 随机分为正常对照组（NC 组）和单眼形觉剥夺组（MD 组），每组8 只。单眼形觉剥夺组大鼠分别行右侧眼睑缝合术，术后饲养6 周(≥8 周龄)，处死2 组大鼠，制作视皮层脑组织切片孵育于人工脑脊液中。根据灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中加入药物的不同，将以上视皮层切片再细分为7 组：正常对照组（NC 组）、剥夺眼对侧视皮层组（CC 组）和剥夺眼同侧视皮层组（IC 组）均未加任何药物，CCI 和ICI 组均加生理盐水，CCII 和ICII 组均加5-羟色胺盐酸盐（10μmol/L）。以上实验动物的饲养和使用均遵循由国家科学技术部颁布的《实验动物管理条例》。

（2）切片脑脊液和人工脑脊液的配制。

参照文献的方法配制切片脑脊液和ACSF， 所需试剂均购于美国Sigma 公司。

（3）大鼠视皮层脑组织切片的制备与孵育。

用10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g）对大鼠进行腹腔注射麻醉，再用提前通氧（95%O2+5%CO2）且预冷（0℃）的切片脑脊液快速心脏灌注，断头取脑，将脑组织冠状切割成厚度400μm 的脑组织切片，视皮层的形态辨别参考文献， 将脑组织切片置于提前通混合氧≥30min 的ACSF 中，孵育1h 待用。

（4）离体脑组织切片视皮层LTP 的诱导。

将1 张脑组织切片置于记录槽内， 通有混合氧的ACSF（28℃-32℃）持续灌流入记录槽，速度为3-4ml/min。参照文献放置刺激电极和记录电极。由Master-9 脉冲刺激器输出刺激（波宽：50μs；频率：0.1Hz），记录基础刺激之前先检测刺激强度与神经元场突触后电位（field postsynaptic potential，fPSP）的关系，选取的最适刺激强度约为最大反应（40-60）%所对应的刺激强度，待fPSP 稳定达10min，给予最适刺激强度的强直高频刺激（high frequency stimulation，HFS，100Hz）诱导LTP，持续记录1h。选取PSP 下行波振幅的10%和50%计算场突触后电位斜率（fPSP slope），设定基础刺激(10min)fPSP 斜率为100%，对HFS 后(51min-60min)fPSP 斜率的变化进行分析。

（5）统计学分析。

（6）应用SPSS21.0 统计学软件进行统计分析，数据以均数±标准差（）表达，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小差异显著法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2、结果

2.1、HFS 诱导的正常对照组和单眼形觉剥夺组双侧视皮层LTP

HFS 后视皮层fPSP 斜率（%）变化：正常对照组为（198.1±13.5）%，剥夺眼同侧视皮层组为（144.5±2.0）%， 剥夺眼对侧视皮层组为（106.3±8.3）%，3 组间差异有统计学意义（F=236.858，P＜0.001），且3 个组之间差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.2、5-HT 对单眼形觉剥夺组大鼠双侧视皮层LTP 的影响

HFS 后剥夺眼对侧视皮层fPSP 斜率(%)变化：生理盐水处理组为（106.3±8.3）%，5-HT 处理组为（156.9±7.5）%，差异有统计学意义（t=-15.766，P＜0.001）；HFS 后剥夺眼同侧视皮层fPSP 斜率(%)变化：生理盐水处理组为（144.8±2.3）%，5-HT 处理组为（192.2±8.6）%，差异有统计学意义（t=-16.958，P＜0.001），且2 个5-HT 处理组之间差异有统计学意义（t=9.367，P＜0.001）（图2)。

图1 HFS 诱导的正常大鼠和单眼形觉剥夺成年大鼠双侧视皮层fPSP斜率(%)变化

图2 5-HT 对HFS 诱导的单眼形觉剥夺成年大鼠双侧视皮层fPSP斜率(%)的影响

3、讨论

从胚胎时期视觉神经系统的发育就已开始并且持续至出生后，这一过程由不成熟逐渐发育至成熟状态。大鼠视觉系统发育的关键期为出生后第14-45 天，成年期为出生后8-48 周。以往人们认为视觉发育关键期结束，视皮层突触可塑性消失，但随着相关研究的深入，发现成年大鼠视皮层仍具有突触可塑性。据此本实验选择出生后2 周龄未睁眼大鼠行右侧眼睑缝合术， 再饲养到至少8周龄，建立经典的单眼形觉剥夺性成年弱视大鼠模型。

视皮层V1M 区称为初级视皮层区， 而视皮层神经回路有垂直连接和水平连接方式两种方式。Li 等人研究发现，视皮层垂直连接神经纤维较水平连接神经纤维成熟的更慢， 表现出的突触可塑性也较大。LTP 作为研究视皮层经验依赖眼优势可塑性的经典指标，被广泛应用于学习记忆相关领域。既往诱导视皮层LTP 采用TBS刺激模式，由于成年大鼠视皮层突触可塑性较幼年鼠下降，本实验采用脉宽较小且频率较高的HFS 诱导成年大鼠视皮层LTP。

Baroncelli 等人研究发现， 丰富环境可恢复成年弱视大鼠眼优势可塑性， 通过高效液相色谱分析法发现居于丰富环境的弱视大鼠视皮层5-HT 含量较正常环境大鼠含量升高，并且在哺乳动物的视网膜和视皮层也存在5-HT。因此，5-HT 与成年大鼠视皮层突触可塑性有相关性，这也和我们的实验结果5-HT 可提高成年弱视大鼠视皮层fPSP 斜率相吻合。

综上所述，在新生大鼠睁眼之前行视觉剥夺至成年期，初级视皮层神经元传导神经冲动的效率降低，突触可塑性明显下调，应用5-HT， 可一定程度促进视皮层神经传递， 从而逆转眼优势柱的转移，这为成人弱视的治疗提供了新的参考依据。