甜菜主要病害抗性育种研究进展

倪洪涛，薛琳，罗世龙，周芹

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜是最重要的制糖原料之一，全世界每年食糖量约1.8亿t，30%来自于甜菜[1]。在伊朗等亚干旱地区，报告了26种甜菜病害，其中，13种由真菌引起，2种由细菌引起，7种由病毒引起，1种由病原体引起，3种由线虫引起。然而，危害最大的是根腐病、褐斑病、丛根病、胞囊线虫病、根结线虫病[1]，而我国主要发生的为前3种。随着近年来全球极端气候变化加剧以及新型化肥、农药等的应用，植物的生存环境在下降，病害的抗性不断在增强，病害的发生并未减弱。据统计，甜菜产量每年因病害损失达16%[2]。提高甜菜产质量需要对病害进行有效的防御，我国耕地面积日益减少、轮作倒茬的年限已无法满足防治病害的要求，在倡导减少农药使用，促进农业可持续发展的今天，培育抗（耐）病甜菜新品种（系）是唯一有效的策略。本文重点综述近10年甜菜褐斑病、根腐病、丛根病的研究进展，深入了解国内外3种病害的发生及危害，掌握甜菜抗病育种的研究动态，对我国提高甜菜抗病能力，培育甜菜抗病品种（系），发展甜菜事业具有重要意义。

1 甜菜褐斑病（Cercospora leaf spot，CLS）研究

1.1 发生与危害

甜菜褐斑病是由甜菜尾孢菌（Cercospora beticola）引发的甜菜叶部真菌病害。褐斑病是甜菜最常见、最具破坏性的病害，各大产区都有发生，可使产量下降10%～15%，含糖降低1～2 度。品种的抗性表现受菌原数量和气候条件影响较大，特别在老甜菜产区或雨水较多地方发病严重[3]。甜菜品种的褐斑病抗性不稳定，不同年份间差异较大，此外，不同甜菜品种间褐斑病抗性差异显著[4]。最近，Vaghefi[5]等以102 株甜菜尾孢菌菌株为材料，根据6个基因座的序列，研究了与甜菜褐斑病相关甜菜尾孢菌种群的分类和进化物种界限，提出今后有必要从形态学和系统发育学对该菌属进行分析从而揭示其物种形成规律。Kremer 等[6]利用英国剑桥环境研究中心（CERC）开发的CERCBET 1 大气预测模型，探讨了气候变化对德国西南地区甜菜褐斑病发生的影响及其区域差异。结果表明，由于气候变化导致甜菜褐斑病发生较早，叶片生长加快，早期甜菜褐斑病发生会导致生长季节延长，从而增加杀菌剂施用量。

甜菜褐斑病的快速、准确鉴别对于甜菜褐斑病综合治理必不可少，通常有肉眼观测和辐射计测量两种方法。传统的视觉诊断往往无法区分褐斑病和其它叶部病害的差别。丁广洲等[7]首次借助热感应光机和X光影像学手段分析褐斑病严重发病地块的甜菜抗感种质叶片的结构特征，并对甜菜抗感病种质的叶片组织和超微结构进行了研究。Hallau等[[8]提出了一种基于智能手机摄像头采集的红、绿、蓝三原色RGB图像数据库识别甜菜叶部病害的方法，精度达82%，对褐斑病、甜菜锈病、白叶枯病等叶部病害的分类准确率均优于甜菜病害分类专家的判断，该工具也适用于其它作物，有助于提高综合病害防治决策水平。

1.2 甜菜抗褐斑病遗传育种研究进展

近年来，甜菜褐斑病的流行呈上升趋势，杀菌剂的使用量不断增加，同时，真菌抗药性也在增强，有效杀菌剂的供应也面临风险。2015 年在波兰，Piszczek 等[9]对从不同地点采集的甜菜尾孢菌进行测试表明，所有耐药菌株均含有一个G/C定点突变，该研究首次提出是基因143位点发生突变(G143A)引发了甜菜尾孢菌抗药性。由于真菌抗药性增强，培育抗褐斑病品种是综合管理的关键。目前，世界各国育成的商用品种只有中等抗性水平，多数品种的抗病性介于父本和母本之间，有时甚至低于双亲的平均值，既高产又抗褐斑病的品种很难育成10]。因此，到目前为止，在商业生产中的应用率一直很低。

加性和非加性遗传效应都有助于褐斑病抗性的表达，基因的加性效应更强[11]。从遗传入手，通过导入真菌病害抗性基因培育抗褐斑病甜菜品种具有重要的意义与价值。Nilsson 等[12]采用AFLP 和RFLP 对204 个单株的分离群体QTL 分析，发现5 个抗褐斑病QTL，调查了甜菜尾孢菌抗性遗传方式。Kazunori 等[26]采用QTL 分析抗褐斑病甜菜品系‘NK-310 mm-O’与感病品系‘NK-184 mm-O’杂交获得的重组自交系（RILs）的抗褐斑病遗传力；复合区间作图（CIM）显示有4 个与甜菜褐斑病抗性相关的QTL，其中两个抗性QTL（qcr1、qcr4 分别位于第三、第八染色体上）使抗病品系的等位基因增强了抗性，这两个抗性QTL 可能在分子标记辅助选育（MAS）中具有特殊的价值。许多甜菜主产国如美国、法国、波兰、瑞典、荷兰等，已鉴定选育出一批优良抗褐斑病品种[14]。对17份甜菜品种进行亲缘关系分析表明，有5个品种抗褐斑病性较好，结合分子标记和田间调查结果进行聚类分析，结果在0.2遗传距离处，供试材料可分为5个类群，第一类群包括两个亚类[15]。最近，德国甜菜抗褐斑病育种取得突破性进展。2014—2016年，Vogel 等[16]对在德国注册的15 个甜菜新品种的褐斑病抗性和耐性进行鉴定，结果显示，所培育的抗褐斑病新品种的产量已经赶上了感病品种，在没有病害的情况下产量不减少，经济表现优于感病品种。Upchurch等[17]以根瘤菌为载体，在甜菜中克隆表达了甜菜褐斑病的抗性基因CFP。杜昕钰等[18]提出转RIP 基因甜菜可增强褐斑病抗性，而对甜菜的生长和生理代谢无不良影响。刘大丽等[19]采用RT-PCR 技术分别对甜菜抗褐斑病基因—几丁质酶At Chitinase1 和葡聚糖酶At Glucanase2进行克隆，获得两个抗病基因功能片段，为培育自主产权的抗病甜菜品种奠定了基础。

2 甜菜根腐病（Sugarbeet root rot）研究

2.1 发生与危害

植物病害的发现和鉴定对于有针对性地应用植物保护措施至关重要。甜菜根腐病是由5种不同病原引发的一种土传根部类病害，其中4种由真菌引发，1 种由细菌引发，因病原物种类多及环境条件差异，症状表现不同[2]。发病初期叶片褪绿黄化，生长缓慢，后期根部发霉变黑，逐步死亡。根腐病是世界性的病害，目前是欧美甜菜生产上最为严重的问题。在中国东北地区发病最重、危害严重，一般造成10%～40%的产量损失[2]。土壤水分含量大、通透性差、盐渍化高、地下害虫和病菌含量多，都有利于病害的发生。土壤水分是整个生长季与病害严重程度相关最密切的环境因子，土壤含水量越高，枯黄镰刀菌发生越重；在干旱年份，该病害严重程度较小，特别是抗病品种；随着作物年龄的增加，枯黄镰刀菌在田间呈逐渐增加的趋势[20]。一般甘薯软腐病菌（Rhizopus stolonifer）不能单独侵染甜菜，2010 年Hanson[21]报道，在美国密歇根州的甜菜产区，一种几乎没有叶、冠部症状的甜菜根腐病发病率增加，经鉴定是由甘薯软腐病菌引起的二次腐烂。

在根腐病中、低风险的土壤中，生物检测和PCR定量监测结果存在差异。但是，PCR定量监测为疾病风险评估提供了一种有价值的新工具，使甜菜种植者能够鉴别根腐病高风险田块[22]。最近发明的光学传感器能够测量病原体，并能客观地测知植物生理上的变化，特别是高光谱传感器，能在不同的水平上识别和定量监测病害,成为植物病害检测的有效工具[23]。

2.2 甜菜抗根腐病遗传育种研究进展

Kakueinezhad 等[24]在温室内测试了10 个甜菜品系生长6 周和12 周两个不同生长阶段对根腐病的抗性，结果表明，甜菜成熟植株的抗性水平较高；生长阶段与甜菜品系之间没有交互作用，这表明了在生长前期评价甜菜根腐病抗性的可行性，从而节省了时间和费用；在这两个不同的生长阶段，对抗病品系（S2-24-P.107）和感病品系（Sb-191）中过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性进行比较，结果表明，抗病品系POD、CAT 和PPO 三种酶的活性和酚类含量均高于感病品系，而接种病菌对APX活性的影响不显著，这表明POD、CAT、PPO 和酚类物质在甜菜根腐病抗性中表现出显著的优势。植物防御蛋白多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）能抑制病原体分泌的多聚半乳糖醛酸酶（PGs），在病害发生初期破坏植物细胞壁。因此，研究PGIPs在植物细胞中的定位，PGIPs与PGs 之间的作用方式及PGIPs 对植物感病的影响非常重要。Haiyan 等[25]研究首次报告甜菜BvPGIP 基因有11 个富含亮氨酸重复（LRR）结构域，该基因对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、葡萄孢菌（Botrytis cinerea）三种不同的真菌病原体均有抗性。

Lein等[26]各以根腐病抗病和感病材料为亲本，构建了其F2、F3代的基因图谱，发现父代抗病基因第38个表达序列上有25 个限制性位点，其中，第4、5、7 位点被定位。日本也从NK-310mm-O 与NK-184-mm-O 杂交后代中分离出一个显性抗病基因Acr1（Aphanomyces cochlioides resistance 1），通过切割扩增多态性序列（CAPS）分析，该基因位于第3 条染色体上[27]。吴旭红[28]采用集团分离分析法（BSA）和ISSR 技术，对甜菜高抗根腐病品种ZD204 及其杂交后代的抗病基因快速标记，获得了一个与抗甜菜根腐病基因连锁的ISSR 分子标记“OPP0760”，该标记可用作甜菜幼苗期抗根腐病鉴定。

2002 年以来，中国农业科学院甜菜研究所与德国KWS 公司合作，相继育成了ZD202、ZD204、ZD206、ZD210、ZTD305 等抗病丰产型品种，对于控制根腐病的发生起到了一定的作用[29]。2013—2014 年，王茂芊等[30]通过对18 份国内外优良甜菜品种进行鉴定，结果，国外品种H809、ST13929、KUHN9046、H003 及国产品种ZTD305、TY310、ZTD304、TY312 表现出稳定的根腐病抗性；2017 年，对国内外11 份甜菜品种根腐病调查结果显示，国外品种感病率为2.9%～4.2%，国内品种感病率为2.0%～3.1%，参试的国内品种的根腐病抗性略好于国外品种[31]。王希等[32]采用表型与分子标记相结合方法研究甜菜遗传多样性，将130 份甜菜种质分成了5个近缘组，相邻组间含糖率、产糖量、根腐病病情指数均有显著差异。

3 抗甜菜丛根病（Rhizomania）研究

3.1 发生与危害

丛根病是世界主要糖甜菜种植地区最具破坏性的生物胁迫之一，是甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）引起的土传病害，又叫“疯根病”。BNYVV 以甜菜多粘菌为传播介体进行传播，BNYVV 分成A 型、B 型和P 型3种主要致病型[33-34]。甜菜发病时叶片黄化、叶脉两侧退绿，最后扩展到整株叶片；地下次生侧根和毛根异常增多，植株矮小。

3.2 甜菜抗丛根病遗传育种研究进展

甜菜丛根病是土传性病害，通过轮作倒茬、早种植等栽培措施对丛根病只起到防御作用；土壤熏蒸等化学防治成本高，对人、畜及环境有害；控制该病害的有效方法是使用抗病品种。抗丛根病基因已使用40 多年了，一直以来“Rizor”或“Holly”（主基因是Rz1）和WB 42（主基因是Rz2）作为抗性种质资源广泛应用于抗丛根病育种中。发病严重时，Rz1 和Rz2 同时作用也能实现很好的抗病性；丹麦也发现了对丛根病有抗性的野生甜菜种质WB41（主基因是Rz3）[35]。Gidner[36]等应用3 种分子标记，对甜菜图谱群进行QTL 分析，鉴定出1 个新的抗性基因Rz4，同Rz1、Rz2 和Rz3 一样也位于第3号染色体上。Funk[37]利用隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）在第3 号染色体的16 Mb 中鉴定出20 个NB-LRR 位点，在亲本C869 中鉴定出含有15 个基因的抗丛根病基因簇。Grimmer 等[38-39]联合应用3 种分子标记，将新的沿海甜菜抗BNYVV 基因Pm3和Pm4定位于第2、4号染色体，观赏甜菜和叶用甜菜的抗性基因Pm5、Pm6定位于第4号染色体；又在来自于意大利的甜菜种质WB258 中，将主基因Rz5 定位；在甜菜亚种的一些品系中也鉴定出一些不同程度的抗病毒单株。Funk 等[40]对3 号染色体Rz 区丛根病抗性区的核苷酸结合域富含亮氨酸重复序列（NLR）图谱进行了表征，识别26 个类似NLR 的序列，长度为20 Mb；这项研究首次对石竹目中一个物种NLR 家族成员进行了详细分类，为更广泛地进行甜菜抗病育种提供理论基础，并提供了一个基于核酸序列预测非模式植物NLR家族的新方法。Pavli用转基因方法获得的甜菜转化植株对甜菜丛根病有一定的抗性[34]。

最近，Broccanello 等[41]采用ELISA 分别检测了一种命名为“AYPR”的新BNYVV 菌株和IV-BNYVV 病毒侵染的甜菜F2分离群体的菌株病毒含量；利用包含384 个单核苷酸多态性（SNP）位点的芯片分别对抗病型和感病型甜菜进行基因分型检测，发现SNP249 与AYPR 病毒的抗病性显著相关（R2=0.37，P=0.004），表明SNP249可作为抗AYPR病毒侵染丛根病育种的分子标记，这一研究引起重大关注。

为丰富高抗丝核菌根、茎腐病的抗性资源，美国农业部农业工程应用技术研究所（USDA-ARS）的育种家们经过对抗性材料GW674、GW359 数轮混合选择后，育成了FC701、702、710 等高抗材料[42]。中国也将培育抗（耐）丛根病甜菜新品种作为重要育种目标，相继育成了‘张甜201’、‘中甜-双丰317’、‘内糖（ND）38’、‘中甜-内糖（ND）37、‘宁甜双优2 号’、‘内甜抗202’、‘ZT-6’、‘农大甜研6 号’和‘XJT9907’等抗（耐）丛根病品种[11，33，43-44]。赵尚敏[45]将形态学标记和SSR分子标记相结合，对59份甜菜抗丛根病种质资源进行聚类分析表明，各材料在表型遗传上差异较大，遗传相异系数在0.18～0.94之间，并将59份种质划分为五大类。

4 我国甜菜抗病育种研究展望

抗病品种的选育和应用是防治病害最有效的途径。我国甜菜抗病育种研究进展与国外还存在很大差距。为此在借鉴国外先进的抗病育种经验，加强以下几方面研究，加速甜菜抗病研究进程。

4.1 以丰产、高糖、兼抗为目标，拓宽遗传基础，丰富甜菜抗病种质资源

抗病的种质资源收集、引进、鉴定、筛选及利用是抗病育种的基础。国外抗性育种起步较早，遗传资源丰富，中国不是甜菜的起源国，遗传基础狭窄，抗性基因源匮乏，许多野生材料及远缘杂交材料等抗性资源在抗病育种中尚未有效利用[46-47]。今后我国的甜菜抗病育种要以丰产、高糖、兼抗为目标，一方面要在现有种质资源中继续筛选抗性基因，另一方面拓宽遗传基础，积极引进国外的抗性资源，丰富抗病种质资源。

4.2 建立高效的分子标记辅助选育（MAS）体系

传统甜菜抗病育种用时长，且常伴有基因连锁现象，难以获得既抗病又高产、优质的品种，采用聚合育种能够克服回交育种只能改良个别性状的局限性[48]。分子标记技术不受大田环境影响，能够实现对基因型的直接选择，不仅可对抗性基因筛选，还可进行甜菜致病菌群的鉴定工作[49]。目前，应用分子标记进行粮食作物抗病聚合育种的报道较多，而甜菜上研究很少，主要限于标记物的开发。至今，只有几个抗病基因的数量、在染色体上的位置以及与其它抗性基因的关系被研究，10个染色体上的位置被确认[28，46，49-50]。

今后，应加强对甜菜抗病基因的精细定位，充分发掘QTL 信息，构建更为饱和的分子标记连锁图谱，建立高效的MAS 体系。要充分借鉴水稻等作物分子标记聚合育种的经验，最好选择一个优良品种（系）为共同杂交亲本，以便在基因聚合时使优良品种在抗性上得到改良，创造具广谱抗性的甜菜种质或品种。

4.3 加强甜菜抗病基因工程研究，加快甜菜抗病育种进程

利用基因工程技术能够将抗性基因转到甜菜体内，有针对性地防御病菌侵染，避免损伤有益菌群和真菌，为抗病育种提供新途径[51]。人工miRNA 技术为抗病毒育种提供了重要的思路和丰富的抗病种质[53-54]。已知甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）是由4～5个RNA 单链组成的一种多段正链RNA 病毒，可借助拟南芥、烟草等上转导表达研究[54]。通过对miRNA 进行深度测序，在被BNYVV 侵染的大果甜菜中发现了来自38 个miRNA 家族的103 个已知miRNA 和45 个潜在的新miRNA，这些miRNA 能够参与激素合成及信号传导等生物途径，该研究对理解BNYVV 的致病机制以及提高甜菜丛根病抗病性具有重要意义[55-56]。然而，目前从非编码RNA 角度对甜菜进行研究的资料比较少[57]。CRISPR/Cas 介导的基因编辑技术是一种可以在对动、植物体内DNA 序列进行定点突变的新技术，最近，利用该技术对病毒所依赖的植物基因进行定点突变或编辑，从而打破病毒与植物基因的互作关系，为创造抗病毒的作物提供了一条行之有效的途径[58]。目前，已从玉米、水稻等植物中成功地克隆到抗病基因，而从甜菜中分离、克隆的报道较少。此外，通过转外源基因获得抗病甜菜的报道也不多，成果集中在甜菜抗丛根病基因工程的研究方面[59]。

今后，应积极开展细胞融合、组织培养、外源DNA 导入、人工诱变技术、非编码RNA 技术、高通量测序，抗病基因分离、克隆、编辑等生物工程手段，进行开放式育种、穿梭式育种[60]，发挥多学科联合攻关及协作，加快甜菜抗病育种进程。