基于微流控技术的细菌检测技术研究①

贾亦琛 徐胜男 林淑英 王晨 张月颖 兰添 宋婷婷 陈培培 宋波

(齐齐哈尔医学院医学技术学院 黑龙江齐齐哈尔 161000)

1 微流控芯片简介

微流控芯片（microfluidic chip）又称微全分析系统(Miniatrized Total AnalysisSystem ，μ-TAS)，是一种若干平方厘米以硅、石英、玻璃或高分子聚合物等材料制作的芯片，具有微米尺度空间并对流体进行操控的技术产品，具有小型化、高通量、试剂消耗微量、分辨率高、自动化、灵敏度高、操作简单等突出优点[1]。微流控芯片利用微米尺度空间对流体进行操控的特征将实验室中：采样、稀释、加样、反应、分离、检测等基本操作集成在一块芯片上，实现常规实验室多功能技术平台。

微控流芯片的加工技术主要依托于微电子加工技术，采用标准软刻蚀工艺加工，即在玻璃基板上旋涂光胶，继而遮蔽含有微通道图形的掩膜，曝光及显影后得到模具。现有的微流控芯片的基本加工技术主要包括注塑法[2]、光刻和蚀刻技术等。注塑法使Soildworks软件设计微流控芯片所需模具结构，使用3D打印机打印芯片模具，其主要优点是模具可多次重复使用万次，芯片加工时间短、成本低、适合芯片的批量产，但其只能使用热塑性材料，模具价格高、制作复杂[3]。

2 传统的微生物检测技术

传统微生物检测有三种方法：(1)直接显微镜观察，正常情况，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。(2)选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件，选择培养基，其作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用类型或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。(3)鉴别培养基，根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。除此之外还包括血清学鉴定和分子生物学鉴定，但微生物的检测金标准仍然是培养法[4]，但该方法耗时长、操作繁琐、灵敏度低，通常要耗时18～24h。

噬菌体裂解试验鉴定菌型，免疫荧光，放射核素和酶联免疫（ELISA）三大标记技术及聚合酶链反应（PCR）等各种微生物学检验新技术也应用于临床。但这些技术操作繁琐、试剂样品耗量大，样品配置、浓缩等步骤耗时长，检测前，需要复杂的样品处理程序，且无法判断微生物是否存活，容易出现假阳性[5]。

3 微流控芯片检测技术在微生物检测中的应用

新型微流控技术现已在核酸分离和定量分析、DNA测序及各类病原体的检测等方面广泛应用，在蛋白、氨基酸、PCR产物等领域也有了成熟的检测技术，其基于免疫分析原理，主要以抗原、抗体和荧光靶标为新型标记物[6]。

现有的新型微流控技术主要包括如下几种：(1)电化学芯片具有灵敏、快速等检测优点，细菌悬液通过检测孔时，表面性质产生不同脉冲信号，并将其转化为细菌数量和种类等相关信息。但电阻抗芯片对设备要求及设计成本，在以后的研究中应努力降低材料成本[7]。(2)基因芯片功能的实现主要基于杂交测序方法，将某种已知核酸探针固定于基质，待测菌的核酸序由于与探针形成特异性反应，从而可以被捕获，依据最大荧光强度的探针分布，从而确定被检测核酸的探针序。(3)环介导等温扩增技术（loop-mediated amplification,LAMP）在细菌、耐药基因、病毒、寄生虫和真菌的鉴定方面近些年受到学者们的广泛关注，其中在细菌检测应用最为广泛。(4)纸质微流控芯片是经过多种加工修饰，使得纸上形成疏水网络[8]，价格低廉且易于携带，但由于其机械韧性较差，方法复杂，制作时间长，因此不利于大规模生产。(5)非接触电导检测分析法是一种能检测色谱柱流出的组分和其量的变化的仪器，其中的电导检测器是离子色谱中最为常见的检测器[9]。(6)介电泳分离技术是基于低压电频信号对中性粒子进行特异性的操控的原理，其反应速度快，可针对多种粒子，因而有更广泛的应用。在微流控系统中介电泳技术是实现粒子分离和富集的关键技术之一。(7)化学发光免疫分析法：化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析相结合而形成的一种新型的检测方法，以化学发光试剂标记抗原或抗体，与待测物经过一系列的免疫反应和理化反应后，根据发光强度判断待测物的含量[10]。在微流控芯片上进行化学发光检测具有显著的优点，非常适合在微通道中进行。

4 微流控芯片的发展趋势及展望

随着各种信息技术的快速发展微流控芯片技术得到了进一步的提升，主要表现在:(1)提高微流控芯片的精准分析能力，并融合多种新技术;(2)将互联网系统与微流控芯片技术相结合。目前,芯片实验技术仍旧处于早期的研究阶段，但芯片技术凭借着其显著的优势以及巨大的商业价值，目前为止也仍然在迅速发展，特别是集PCR技术、毛细管电泳、荧光标记于一身的微流控芯片，其在基因测序、基因表达、疾病诊断等各个领域的应用前景已经获得人们的极大关注[11]。

过去十年中提出了很多快速检测细菌的方法，如基于核酸(PCR，NASBA和RPA)，基于免疫学(ELISA，LFD和LAT)，以及基于生物传感器(光学，电化学和基于质量的生物传感器)方法，但这些方法都存在许多不足[12]，无法满足临床对于病原微生物快速诊断及治疗的需求。从目前发展现状来看，微流控芯片已经突破了传统及原有技术所带来的难题，并且在众多领域中有了更深层次的研究，并不断扩大应用范围于更多领域。相信在未来的几年内，以微流控技术为核心的技术将会取代更多的检测系统，给人们带来更便捷、安全、高效、灵敏的检测产品。