嵌合抗原受体T细胞治疗胶质母细胞瘤研究进展

曹军 程也 巴特尔 凌锋 林庆堂

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，即使经最大程度手术切除辅以放化疗等标准方案治疗，高级别胶质瘤仍无法治愈，其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅有14.6个月［1］。脑胶质瘤的综合治疗包括传统手术治疗、放射治疗、药物化疗、分子靶向治疗、肿瘤治疗电场（TTF）、免疫治疗等。尽管长久以来针对胶质瘤分子分型及突变靶点进行了大量研究，但迄今仍未发现具有特异性的靶向治疗药物。肿瘤免疫治疗始于19世纪末，最初只是尝试用于治疗骨肉瘤，随着研究的不断深入逐渐筛选出大量具有特异性的不同类型的免疫标志物，尤其是近年嵌合抗原受体T细胞（CAR⁃T）构建成功，可通过免疫检查点封锁或构建免疫细胞而实现靶向免疫治疗，使得该项治疗方法有望成为今后针对脑胶质瘤的新的研究方向［2⁃4］。免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂、针对肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原疫苗、CAR⁃T细胞等，但与血液系统恶性肿瘤的显著疗效相比，CAR⁃T细胞疗法对脑胶质瘤等实体肿瘤的疗效十分有限［5］。然而，2015 年 Brown 等［5］通过对胶质母细胞瘤患者CAR⁃T细胞治疗的有效性和安全性进行观察，证实其对脑胶质瘤等实体肿瘤具有巨大的应用前景［6］，使得免疫疗法在此领域的临床研究获得突破性进展，本文拟就CAR⁃T细胞疗法在胶质母细胞瘤免疫治疗中的作用机制、研究现状、挑战与展望进行概述。

一、CAR⁃T细胞及其作用机制

1.CAR⁃T细胞构建 通过基因工程将T淋巴细胞（以下简称T细胞）与特定抗原的嵌合抗原受体（CAR）相结合，构建CAR⁃T细胞。CAR为人工融合蛋白，包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号转导结构域［7］。采用基因工程技术在体外将识别肿瘤相关抗原的单链抗体片段（scFv）与T细胞的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）进行基因重组，以逆转录病毒或慢病毒为载体感染患者外周血被扩增、激活的T细胞，然后再回输至患者体内［8］。CAR⁃T细胞的发展可分为四代：第一代CAR⁃T细胞由单链抗体片段经跨膜区与免疫受体酪氨酸活化基序相连，仅可引起较短时间的T细胞增殖和较低水平的细胞因子分泌，抗肿瘤效果欠佳［9］；因淋巴细胞活化时呈双信号模型，且T细胞增殖不可缺少第二信号即共刺激信号的参与，故在第二代CAR⁃T细胞的免疫受体酪氨酸活化基序中引入共刺激分子1（CM1）；第三代CAR⁃T细胞引入双共刺激分子CM1和CM2，从而提高细胞毒性、加快增殖、延长存活时间、促进细胞因子释放［10］；第四代CAR⁃T细胞在第三代基础上添加编码CAR基因和启动子的载体，以提高其表达效率，进一步增强对肿瘤细胞的杀伤能力。因此，一旦确定了适宜的靶点即肿瘤相关抗原，则可针对该抗原的特异性CAR⁃T细胞，即能够以不依赖人类白细胞抗原（HLA）的方式诱导产生持久性抗肿瘤免疫反应［11］。

2.CAR⁃T细胞疗法在胶质母细胞瘤免疫治疗中的作用机制 CAR⁃T细胞疗法治疗实体肿瘤的基本原理是免疫介导。肿瘤细胞坏死后释放的细胞碎片和肿瘤相关抗原激活一系列抗肿瘤免疫反应，由释放促炎性因子介导肿瘤细胞坏死的先天性免疫细胞启动，树突状细胞（DC）通过捕获肿瘤相关抗原，在促炎性因子的作用下逐渐成熟，并在淋巴组织中刺激T细胞增殖，激活抗原特异性适应性免疫应答，从而导致肿瘤细胞死亡；此时，肿瘤细胞通常做出适应性改变以逃避机体免疫系统的识别和破坏［12］。肿瘤细胞通过聚集异质性淋巴细胞和释放免疫抑制性细胞因子，抑制进入肿瘤的免疫细胞的功能，其中包括树突状细胞［12］。未完全成熟的树突状细胞无法有效激活幼稚T细胞，反而诱导T细胞丧失功能、凋亡或对肿瘤相关抗原产生免疫耐受；肿瘤细胞通过减弱抗原提呈作用和形成新的失去抗原性的变异体，以逃避被进入肿瘤的免疫细胞识别［13］。而CAR⁃T细胞对肿瘤相关抗原的识别并不依赖树突状细胞的抗原提呈，故不受主要组织相容性复合物（MHC）表达下调的影响，因此，通过优化CAR结构和培养条件，制备具有超级细胞毒性且不被肿瘤免疫抑制机制影响的CAR⁃T细胞［6］。

二、CAR⁃T细胞治疗脑胶质瘤的临床研究

20世纪90年代，T细胞工程作为免疫疗法开始逐渐受到关注，此后不断有实验室研究成果见诸文献报道，至21世纪初，CAR⁃T细胞疗法在临床试验中取得重大突破［14］。根据临床前研究，用于治疗高级别胶质瘤的CAR⁃T细胞表面标志物主要包括白细胞介素⁃13受体α2（IL⁃13Rα2）、人表皮生长因子受体2（HER2）和表皮生长因子受体变异体Ⅲ（EGFRvⅢ）［15⁃16］。

1.IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞 IL⁃13Rα2是一种高亲和力的单体形式的IL⁃13受体，逾75%的胶质母细胞瘤过表达 IL⁃13Rα2［17］。在多种高级别胶质瘤细胞表面生物学标志物中，以IL⁃13Rα2与间充质信号基因的关系最为密切，表明其与间质细胞的促炎症反应特性有关［18］，故推测可能与肿瘤侵袭性增强和不良预后有关［19］。IL⁃13Rα2在肿瘤干细胞（TSCs）、分化程度较高的恶性肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和（或）骨髓来源抑制细胞（MDSC）中均有表达，但在正常脑组织中的表达较低［20］，因此被认为是CAR⁃T细胞疗法的重要靶点。对胶质瘤小鼠模型的观察显示，CAR⁃T细胞疗法可促进小鼠体内产生有效的抗肿瘤免疫反应［20］，该结果尚未经临床验证。早期临床试验证实靶向IL⁃13Rα2的肿瘤疫苗治疗胶质母细胞瘤安全且耐受性良好：2015年，Brown等［5］首次报告其针对复发胶质母细胞瘤患者进行的第一代IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞安全性和疗效观察结果，该项研究共纳入3例患者，且均为生存期有望超过3个月的复发高级别胶质瘤，KPS评分均＞70分；于颅内接种相同剂量［（10～100）×106细胞/次］的靶向IL⁃13Rα2的IL⁃13（E13Y）⁃Zetakine CD8+细胞毒性T细胞（CTL），疗程共5周，其中，第1、2、4和5周为接种治疗，第3周为间歇期，每周第1、3和5天接种，第3（间歇期）和5周时进行疗效观察，结果显示，3例患者平均生存期为11个月，生存期最长者约14个月，术后头痛、短暂性神经功能缺损等不良反应轻微；治疗5周后，1例肿瘤组织内IL⁃13Rα2表达水平明显降低、1例头部MRI显示注射部位肿瘤坏死体积增大［5］。该试验为首次制备靶向IL⁃13Rα2 CAR⁃T细胞获得成功，并通过储液/导管系统植入复发胶质母细胞瘤患者体内的临床案例，治疗期间以及治疗后患者对CAR⁃T细胞耐受良好，同时，可以观察到CAR⁃T细胞的抗胶质瘤反应，该项研究成果为颅内接种IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞治疗胶质母细胞瘤提供了临床经验和可行性［5］。2016 年，Brown 等［21］继续进行第二代IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞的临床试验：首先于瘤内注射2×106个细胞，再次注射则减至1×106个细胞；然后，再以1×106细胞/次的剂量注入侧脑室系统，共注射10次；治疗后133天MRI显示所有患者颅内和脊柱肿瘤均消退，脑脊液检测细胞因子和免疫细胞水平升高，这种临床反应平均持续约7.5个月，且治疗期间患者未发生3级或以上不良事件。此外，IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞试验的另一突破点，是通过PET显像监测到CAR⁃T细胞在脑组织中的传递：Keu 等［22］采用18F⁃FHBG PET对表达Ⅰ型单纯疱疹病毒⁃胸苷激酶（HSV1⁃tk）的IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞在颅内增殖能力追踪观察，发现表达HSV1⁃tk的CTL细胞摄取能力显著强于单纯T细胞。虽然该项研究的样本量很小，但其结果仍提示IL⁃13Rα2特异性CAR⁃T细胞疗法安全、可行。

2.HER2特异性CAR⁃T细胞 HER2是一种在多种肿瘤细胞中呈过表达的受体酪氨酸激酶，其被认为是胶质母细胞瘤靶向CAR的理想肿瘤相关抗原［23］。美国德克萨斯州贝勒医学院开展的第二代HER2特异性CAR⁃T细胞联合替莫唑胺等药物治疗HER2阳性胶质母细胞瘤的研究，并于2017年公布了Ⅰ期临床试验结果：17例患者予以静脉滴注第二代HER2特异性CAR⁃T细胞，每次输注（1～100）×106个细胞，于6周后进行疗效评估，选择其中疗效显著者再接受6周与前期方案相同的治疗；12周后所有患者的定量聚合酶链反应（qPCR）检测结果均显示，其体内HER2特异性CAR⁃T细胞呈阳性，最长者可于体内持续存在12个月，其中15例患者治疗后3小时外周血细胞数目即达峰值水平，2例分别于治疗后1和2周达峰值，有7例患者治疗后6周仍可在血液标本中检测到HER2特异性CAR⁃T细胞，此后血药浓度逐渐下降，但有2例治疗后12个月仍可检测到CAR⁃T阳性细胞，18个月后所有患者外周血检测均转阴，表明HER2特异性CAR⁃T细胞在患者体内不产生扩增反应，但可以维持低水平存在1年；17例中1例死亡、16例仍在随访中，后者有1例部分缓解持续9个月以上、7例病情稳定8周至29个月，其余8例病情仍有所进展［24］。该项研究采用第二代HER2特异性CAR⁃T细胞治疗HER2阳性胶质母细胞瘤患者的策略，是基于依赖病毒特异性T细胞中CAR的表达，即病毒特异性T细胞通过CAR能够提供预期的抗肿瘤反应，但在天然T细胞受体与专业抗原呈递细胞（APC）提呈的潜伏病毒抗原结合后也可受到适当的共刺激［24⁃25］。此外，贝勒医学院Ⅰ期临床试验所采用的CAR⁃T细胞以腺病毒、EB病毒（EBV）或巨细胞病毒（CMV）为载体，在经CAR⁃T细胞治疗的17例患者中，血清中经检测均具有腺病毒、EB病毒的特异性T细胞，其安全性已经造血干细胞（HSCs）移植试验证实［25］。尽管，贝勒医学院的Ⅰ期临床试验报告仅为中期观察结果，但已经证实病毒特异性CAR⁃T细胞治疗胶质母细胞瘤可行且安全，尽管CAR⁃T细胞不能在患者体内扩增，但初步结果仍令人鼓舞［24］。

3.EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞 EGFRvⅢ系外显子2～7框内缺失所致，是人类肿瘤中最常见的EGFR基因变异体［25］，约40%的新发胶质母细胞瘤患者体内存在EGFR基因扩增，其中，约50%含有组成型活性和致癌性EGFRvⅢ［26］。胶质母细胞瘤患者的总生存期（OS）较短，尽管最近研究结果显示EGFRvⅢ阳性患者预后与EGFR基因扩增患者无显著差异［27］，但是EGFRvⅢ突变产生的氨基酸序列在外显子1和8交界处产生新的甘氨酸残基，可在EGFR胞外域产生肿瘤特异性和免疫原性表位。目前已研制出针对EGFRvⅢ的疫苗和CAR⁃T细胞，正在进行的Ⅰ期临床试验首次对EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞的安全性进行人体试验：10例复发胶质母细胞瘤患者经静脉滴注治疗剂量的EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞，平均剂量为500×106个细胞，平均治疗4个周期，无一例发生肿瘤以外的毒性反应或细胞因子释放综合征［28⁃29］。由于该试验观察终点并非治疗有效性，因此未报告治疗后肿瘤消退与否的相关信息；然而值得注意的是，由于该试验所纳入的10例患者中9例为多灶性病例，且所有患者在入组前均已接受过不同程度的药物化疗或放射治疗，接种CAR⁃T细胞时MGMT启动子区也未发生甲基化，故整体预后较差。虽然该试验入组病例治疗后外周血均可检测到EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞，但植入程度明显低于包含相同4⁃1BB共刺激域的CD19特异性 CAR⁃T 细胞［29］，在 7例接种 CAR⁃T 细胞后接受神经外科手术的患者中，2例于2周内切除颅内肿瘤，后者CAR⁃T细胞运输及其他药效学终点特异性分析，提示脑组织中EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞数目明显高于外周血，qPCR分析显示，脑组织中EGFRvⅢ特异性CAR⁃T DNA序列分别高于外周血3倍和100倍，提示CAR⁃T细胞接种后可有效转运并在其活动区域内原位扩增［29］。在明确EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞具有肿瘤组织运输功能的同时，该试验还对EGFRvⅢ表达水平和接种CAR⁃T细胞后的肿瘤免疫微环境进行观察［25，30］，结果显示，除外1例患者外周血CAR⁃T细胞扩增不良且肿瘤组织中未检测到CAR⁃T细胞（患者经历早期肿瘤进展），其余9例均于接种后出现特定的EGFRvⅢ丢失或表达下调，尽管目前尚无法排除EGFRvⅢ水平降低可能与CAR⁃T细胞疗法以外的因素有关，但既往研究已证实EGFRvⅢ表达变化呈时空变异性［30］。最新研究结果认为，经CAR⁃T细胞治疗后，绝大多数EGFRvⅢ阳性胶质母细胞瘤患者外周血中的EGFRvⅢ表达均有下降甚至消失，提示EGFRvⅢ丢失更可能与CAR⁃T细胞成功靶向EGFRvⅢ阳性肿瘤细胞有关［31⁃32］。上述研究表明，CAR⁃T 细胞靶向EGFRvⅢ阳性肿瘤细胞可在肿瘤微环境（TME）中诱导代偿性免疫抑制反应。尽管静脉滴注可导致脑组织靶向活动，但克服局部肿瘤微环境的适应性变化并解决抗原异质性，可能有助于改善EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞在胶质母细胞瘤中的疗效。

三、挑战

CAR⁃T细胞疗法在B细胞白血病和淋巴瘤患者的治疗中已取得巨大成功，但对胶质瘤患者的疗效差强人意，这主要是由于中枢神经系统独特的肿瘤微环境、CAR⁃T细胞难以到达肿瘤部位、靶抗原的异质性等。

1.肿瘤微环境 CAR⁃T细胞疗法用于胶质母细胞瘤首先需解决的问题之一，是免疫抑制微环境。一旦CAR⁃T细胞到达肿瘤部位，肿瘤微环境即产生诸多障碍，如由肿瘤细胞衍生的可溶性因子和细胞因子、抑制性免疫细胞及物理或代谢障碍等［32⁃33］。胶质母细胞瘤微环境中的细胞因子网络主要包括前列腺素 E2（PGE2）、IL⁃6、IL⁃10和转化生长因子⁃β（TGF⁃β），这些细胞因子均可抑制T细胞增殖和效应器反应［34］。与此同时，CAR⁃T细胞的疗效还受肿瘤应激代谢的影响，首先，低氧是胶质母细胞瘤的主要特征，具有免疫抑制作用［35］；其次，营养缺乏是胶质母细胞瘤微环境的典型特征［25］。由于神经元和肿瘤细胞几乎完全依赖糖代谢，因此葡萄糖缺乏的胶质母细胞瘤微环境中，饥饿的T细胞需增加糖摄取和糖酵解以支持T细胞增殖和功能［33］。

2.肿瘤异质性和抗原丢失 肿瘤异质性是胶质母细胞瘤耐药的根本原因［36］，可能是影响CAR⁃T细胞疗法远期疗效的最关键因素之一［37］。IL⁃13Rα2和EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞的表达变化，在胶质母 细 胞 瘤 患 者 之 间 、患 者 内 存 在 异 质 性［31，37］。O'Rourke等［29］通过对 1例接种 EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞的胶质母细胞瘤患者不同注射部位的反复组织活检证实，空间异质性对疗效具有重要影响，且肿瘤不同区域EGFRvⅢ表达水平亦存在较大差异，提示CAR⁃T细胞在肿瘤的不同部位具有不同程度的疗效。所有关于EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞的研究均提出一个重要问题，即对单个抗原的成功免疫靶向能否转化为持久的临床获益或者抗原逃逸能否导致最小的临床影响，这取决于CAR⁃T细胞疗法在何种程度上诱导肿瘤细胞间接杀伤和（或）触发抗原/表位扩散。由CAR⁃T细胞诱导的针对肿瘤相关抗原的内源性CD8+T细胞反应，可能发生在CAR⁃T细胞破坏其靶肿瘤细胞并分泌刺激性细胞因子而导致免疫激活微环境释放肿瘤相关抗原时［28，35］。尽管有临床前研究支持 EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞存在抗原扩散的可能［16］，但其在人类免疫反应中的扩散程度尚不十分清楚，如果未发生抗原扩散，则需要联合肿瘤相关抗原以靶向应对肿瘤异质性。

3.T细胞增殖与持久性 由于第二代CAR⁃T细胞可在患者体内扩增，故其给药途径并不遵循经典的药代动力学模式。例如，在血液系统恶性肿瘤中，单剂量CAR⁃T细胞即可诱导持续的抗肿瘤免疫反应［25，38］，但是用于实体肿瘤时，则需在外周血扩增T细胞，达到有效的T细胞/肿瘤细胞比例后方可能产生预期临床疗效［6］。然而，实体肿瘤的外周血并不宜作为治疗靶点，故有效的CAR⁃T细胞剂量，以及给药频率和（或）时间尚难以确定。有研究显示，接种EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞后1～2周在脑组织所检测到的EGFRvⅢ阳性CAR⁃T细胞峰值与外周血的峰值吻合［30］，但仍有部分患者接种EGFRvⅢ特异性CAR⁃T细胞后2～3个月仍未在肿瘤组织中检测到EGFRvⅢ阳性CAR⁃T细胞，由此也提出一个问题，即反复静脉滴注CAR⁃T细胞能否导致T细胞在肿瘤部位的持久扩增。

四、展望

尽管CAR⁃T细胞治疗胶质母细胞瘤的探索尚处于起步阶段，但是早期研究结果已证实CAR⁃T细胞疗法具有可行性和安全性，并且获得初步疗效。未来面临挑战众多，例如增加CAR⁃T细胞的浸润程度、优化给药剂量和频率、调节免疫抑制微环境，以及可能最重要的解决胶质母细胞瘤的分子异质性。IL⁃13Rα2、EGFRvⅢ以及 HER2是首次探索CAR⁃T细胞治疗胶质母细胞瘤的CAR靶标，目前仅有少数的潜在抗原正用于探索CAR靶向疾病，尚待进一步研究。

利益冲突无