肠道病毒71型致病机制及免疫反应研究进展

施梅言 ， 陆彩霞 ，代解杰

（中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，昆明 650118）

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是单股正链小RNA病毒，无包膜，属于肠道病毒科肠道病毒属，是正二十面体颗粒。EV71核酸长约7.4 kb，两端分别为5'-UTR和3'-UTR，中间是单一的开放阅读框，可编码多聚蛋白；而多聚蛋白可被宿主和病毒蛋白酶水解，可产生4个病毒衣壳结构蛋白V P 1～V P 4和7个非结构蛋白（2A～2C，3A～3D），其中VP1、VP2、VP3 暴露于病毒衣壳的外侧，VP4包埋于内侧，抗原决定簇基本位于VP1～VP3[1]。EV71是引起手足口病（hand, foot and mouth disease，HFMD）的主要病原体之一。HFMD主要发生在5岁以下儿童[2]，可通过呼吸道、消化道和密切接触传播。EV71感染引起的HFMD，除了手足口症状外，还能导致神经系统疾病，如神经源性肺水肿、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹等，严重威胁儿童的生命健康安全[3]。我国自1981年在上海发现HFMD以后，北京、河北等十几个省均有报道，香港地区1987年发生过EV71流行；1998年我国台湾省发生EV71引起的感染疾病和疱疹性咽颊炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129 106例，其中重症患者405例，死亡78例，死亡病例大多为5岁以下的儿童[4]。自2008年开始HFMD发病率呈逐年上升趋势，2013～2014年增长速度最快，达到70.03/10万[5]。然而，目前关于EV71如何入侵神经系统的致病机制尚不明确。本文就EV71的致病机制及免疫反应研究进展进行综述，为今后EV71重症患者的救治和疫苗及药物的研发提供理论依据。

1 致病机制

EV71入侵人体后，若机体未产生足够抗体清除病毒，病毒随血液循环导致第一次病毒血症。若机体免疫力差，EV71入侵淋巴结、肝、脾、骨髓等靶器官，经血液循环，引发严重病变，临床表现为脊髓灰质炎、脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹或心肌炎等[6-7]，其中以脑组织病变最为严重，提示EV71可能由血脑屏障进入神经系统，或通过周围神经的轴突由逆向轴浆的方式进入。重症HFMD患者病情发展迅猛，甚至导致死亡。有研究表明，部分成人感染EV71后可通过接触传播将病毒传染给儿童使其致病[8]。

1.1 EV71感染对神经系统的致病机制

目前HFMD动物模型主要包括BALB/c小鼠模型、ICR小鼠模型、免疫缺陷小鼠模型、中缅树鼩模型及猕猴模型等。Caine等[9]成功建立了免疫缺陷小鼠模型，并通过腹腔注射途径感染时小鼠出现神经系统病变，表现为肢体瘫痪和死亡，在其肠道和中枢神经系统中均能检测到病毒蛋白。EV71感染的重症患者中，发现脑组织病变最为严重。李军等[10]通过EV71感染小鼠模型发现，EV71存在中枢神经系统的病变部位，提示EV71可直接造成中枢神经系统（CNS）损伤。Lin等[11]通过对EV71感染死亡患儿的尸解发现，脑膜表面有中性粒细胞浸润，脑实质有大范围中性粒细胞，神经元细胞坏死，脑干和脊髓严重受累。郝博等[12]通过尸检在感染者CNS中发现EV71及炎症存在。Khong等[13]通过口服途径感染小鼠时，缺乏外源性抗体的AG129小鼠出现肢体瘫痪和死亡，肠道感染和口腔感染的中枢神经系统均检测到病毒蛋白。Liou 等[14]通过EV71感染杂交小鼠时出现了肢体瘫痪，但在肌肉中没有检测到病毒RNA或蛋白质，仅在中脑和脊髓等中枢神经系统中显示出高密度的病毒蛋白，这表明瘫痪仅仅是由中枢神经系统损伤引起的，而不是肌炎和肌肉破坏。有学者[15-16]推测EV71侵入机体后可能通过逆向轴突运输途径累及CNS，这可能与EV71具有嗜神经性及病毒衣壳蛋白有关。Fu等[17]通过小鼠实验也证实，神经通路的逆行轴突运输可能是EV71累及CNS的主要方式。病毒感染后激发机体免疫反应，释放多种细胞因子，形成“风暴”引起全身炎性反应，导致多脏器功能衰竭。患者的CD4、CD8、T细胞和自然杀伤（NK）细胞耗竭。在脑干脑炎患儿中，神经系统炎性反应伴有白细胞介素10（IL-10）、 IL-13 和干扰素-γ（IFN-γ）产生以及淋巴细胞损耗，导致机体的免疫功能下降，病情加重。因此，对EV71致病机制的深入探索有利于重症患者的治疗。

1.2 EV71感染对神经源性肺水肿的致病机制

Dong等[18]通过静脉、呼吸道途径感染3～3.5岁猕猴，成功建立了EV71猕猴模型，均能引起中枢神经、呼吸系统明显的病理改变，表现为肺气肿、肺出血、神经元损伤和炎性细胞浸润等特点。神经源性肺水肿是HFMD患儿死亡的主要原因之一，神经源性肺水肿的发生是一个复杂的病理生理过程，主要与CNS 损伤后神经因素、体液因素、生物活性因子等有关。动物实验和病理检查发现，EV71 感染的肺组织表现为肺部充血水肿并伴有局灶性出血，并且从中未分离到EV71 病原体，另外心脏组织病理检查无明显炎性改变，结合肺水肿发生过程中伴有神经性尿潴留、肠麻痹、多汗、失眠和心动过速等自主神经功能失调表现，推测EV71 感染后的肺水肿是神经源性[19]。王文广等[20]采用滴鼻、灌胃等途径感染中缅树鼩，成功制备了HFMD模型并出现与人类相似的症状，如心、肺、肠、脾和肾等部位出现组织变性坏死、水肿、炎性细胞浸润等病理改变。杨坤等[21]研究认为，EV71感染后所致神经源性肺水肿的发病机制可能是EV71入侵CNS后并发脑干脑炎，造成视丘下部和延髓孤束核功能紊乱，机体的应激反应导致交感神经兴奋，血中儿茶酚胺（肾上腺素、去甲肾上腺素等）含量显著增高，进而全身血管收缩，血流动力学急剧变化，动脉血压急剧增高，体循环内大量血液进入肺循环；一方面肺毛细血管床有效滤过压急剧增高，大量体液滞留在肺组织间隙，从而形成肺水肿；另一方面血流冲击造成血管内皮细胞损伤，同时体内血管活性物质（如组织胺和缓激肽等）大量释放，使血管通透性增加，大量血浆蛋白外渗，导致急性肺水肿进一步加重。

Liao等[22]发现用EV71感染小鼠时，会产生一些炎性因子，如IL-6、IL-10和IFN-γ。Chen等[23]研究发现，EV71重症患者中被感染的免疫细胞可使促炎因子大量释放，而促炎因子也与肺水肿有关。人类树突状细胞会在病毒感染的条件下释放促炎因子IL-6、IL-12 和肿瘤坏死因子α（TNFα）[24]，也可诱使人类T细胞、巨噬细胞和人类单核细胞产生促炎因子，如TNFα和巨噬细胞迁移抑制因子[25]。Jin等[26]建立了EV71感染的小鼠模型，发现EV71感染后，小鼠的大脑、肺和骨骼肌中均可见肥大细胞的积累、激活和过敏性炎症，在小鼠的肺中IL-4、IL-5、IL-13和TNFα水平升高。细胞因子“风暴”的发生对机体的免疫耐受产生严重的影响，也是引起EV71重症患者死亡的重要原因。EV71入侵机体后，首先破坏脑干中具有特定功能的调节结构，引发神经功能紊乱，最终导致神经源性肺水肿的发生。因此，对重症患者的细胞因子水平进行严密监测，有助于患者治疗，进一步降低EV71的致死率。

2 EV71感染引起的固有免疫反应

固有免疫是机体抵御病毒入侵的第一道防线，病毒入侵后，会被模式识别受体（patternrecognition receptors，PRR）如Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）、维甲酸诱导的基因Ⅰ样受体[retinoid acid-inducible geneⅠ（RIG-Ⅰ）-like receptors，RLR]识别，激活固有免疫系统，使其产生促细胞因子和Ⅰ型干扰素，对病毒进行抵御和清除。Lei等[27]研究发现，当EV71重症感染时，Ⅰ型干扰素缺失，而其他细胞因子水平异常增高，这表明固有免疫反应失衡。Khong等[13]发现，免疫缺陷的AG129小鼠缺乏Ⅰ型和Ⅱ型干扰素受体时，可通过腹腔注射和口服途径感染非小鼠适应的EV71，受感染的小鼠在死亡前表现出肢体瘫痪。越来越多的病毒感染致病机制研究表明，机体的固有免疫应答具有抵抗病毒感染的能力，是通过活化PRR通路，产生干扰素，PRR（包括TLR和RIG-Ⅰ）通过识别不同途径的病毒核酸，招募特异接头蛋白，激活一系列信号级联反应，引发Ⅰ型干扰素和促炎因子的产生。研究表明，IFN-α的表达能显著降低EV71的感染率。

固有免疫的调控需要免疫细胞的参与，包括吞噬细胞、NK细胞、自然杀伤T（NKT）细胞、γδT细胞和 B1 细胞等。在EV71 重症患者的血清和脑脊液中能够检测到包括IL-6、IL-10、IL-13、TNFα、IL-1β和IL-8 等在内的大量炎性因子和趋化因子的异常增高[28-32]。TLR和RLR通过对病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）的识别，触发下游固有免疫，激活相关信号通路，主要包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核转录因子κB（NF-κB）、TANK 结合蛋白激酶1-干扰素调节因子3信号通路和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）信号通路[33]。EV71感染时，在激酶活化下，TAK1结合蛋白1（TAK1-binding protein 1，TAB1） 能够使I κB激酶（I κB kinase，IKK）复合物磷酸化，最后激活 NF-κB和AP-1，两者均可调控前炎性因子的基因转录过程[34]，同时产生IL-6、IL-8 和 IL-1β及相关炎性因子，抵御EV71感染。研究表明，当EV71入侵时，TLR3 通过招募干扰素诱导型含TIR结构域的接头分子（TRIF），经泛素化激活下游信号转化生长因子活化激酶1（TAK1），继而使IKKα、IKKβ磷酸化，最终活化 NF-κB，从而介导 MyD88 非依赖性信号通路[35]，诱导细胞因子及干扰素的表达，从而抑制EV71的复制。

Meng 等[36]研究发现，在 EV71 轻症、重症感染患者和健康对照人群的外周血单核细胞（P B M C）中，有8 5 4 1个长链非编码R N A（lncRNA）发生差异表达变化，其中大量lncRNA与固有免疫和炎性反应密切相关，提示lncRNA在EV71感染固有免疫调控过程中也可能扮演重要角色。研究 EV71 感染与其触发的固有免疫反应之间的相互作用机制，寻找EV71致病过程中关键的宿主分子或病毒蛋白等作为靶标，对疫苗和药物的研发有积极的推动作用。近年来研究取得了一定的进展，如Liao等[37]采用小鼠适应EV71株（MP4）感染的7日龄ICR小鼠模型，探讨二甲胺四环素治疗EV71感染的抗炎抗病毒作用，发现二甲胺四环素降低了细胞病理效应（C P E s）、病毒蛋白表达、病毒滴度、I L-6和IL-8的水平，证明二甲胺四环素在感染和炎症神经系统疾病模型中具有抗炎和免疫调节特性；另有研究[38]发现，以 NF-κB 通路为作用靶点可以抑制 EV71的复制。近年来，随着EV71感染固有免疫反应调控研究的不断深入，人们对免疫调控有了更深入的认识，为今后深入研究EV71感染引起的固有免疫反应提供了新思路。

3 EV71感染引起的适应性免疫

病毒入侵机体后，可诱发机体产生适应性免疫，包括T细胞介导的细胞免疫与B细胞介导的体液免疫，主要依靠特异性T细胞活化发挥免疫效应，以及依靠B细胞产生特异性的抗体发挥免疫效应，达到清除病毒的目的。有研究发现，在感染前或感染后对小鼠注射一种EV71特异性中和抗体，可以在B细胞缺乏的C57BL/6来源小鼠中显著降低小鼠致死率和组织中的病毒载量[11]。T细胞膜表面有100多种特异性抗原，两群辅助性T细胞（T h）克隆均能诱导抗原提呈细胞（A P C）表达主要组织相容性复合体（M H C）Ⅱ类抗原，T h 1通过I F N-γ诱导巨噬细胞（macrophages，Mφ）表达Ia抗原，而Th2通过IL-4对Mφ和B细胞Ia抗原表达起正调节作用，对抗病毒免疫应答进行调节[39]。细胞毒性T细胞表面表达CD8，这类细胞可以通过MHC Ⅰ类抗原直接结合识别内源性抗原，对靶细胞产生直接杀伤作用，进行病毒清除。

刘莉等[40]研究表明，感染 EV71可通过凋亡引起 NK 细胞、CD3+T细胞等淋巴细胞减少，对机体免疫反应产生抑制作用。B细胞不仅表达MHC Ⅰ类抗原，而且表达较高密度的MHCⅡ类抗原，B细胞表面的MHCⅡ类抗原在B细胞与T细胞相互协作时起重要作用，此外，还参与B细胞作为辅佐细胞的抗原提呈作用。B细胞表面的CD40与T细胞表面的CD40L交联，能诱导B细胞免疫应答，促进细胞因子释放。Johnson等[41]研究表明，缺乏IFN的AG129小鼠，也能产生有效的体液和细胞免疫。据报道，滤泡辅助性T细胞（一种新的CD4+T细胞亚群Tfh），在抗体产生过程中发挥着重要的作用，其主要功能是辅助B细胞增殖、分化，继而参与到抗体产生及体液免疫应答[42]。有研究表明，Th1 向 Th2 细胞转变，从而产生免疫抑制效果，同时也是促进HFMD发展的重要机制之一[43]。Imura等[44]发现，用甲醛溶液灭活的EV71皮下接种免疫成年转基因小鼠，该疫苗在免疫小鼠中诱导了足够水平的中和抗体，大多数免疫小鼠存活，无临床症状或组织病理学损伤，免疫小鼠的病毒复制明显低于未免疫小鼠。总之，固有免疫和适应性免疫在EV71感染过程中被激活时，二者通过协同作用对病毒进行清除，两者密不可分，互相影响。

4 免疫原性

预防性疫苗的研发是控制EV71感染引起HFMD最有效的方法，目前中国医学科学院医学生物学研究所（IMBCAMS）和北京科兴生物制品有限公司（Inovac）研发的EV71灭活疫苗已经实现量产。免疫原性研究疫苗的种类包括灭活疫苗、杆状病毒表达的病毒样颗粒（VLP）疫苗和大肠埃希菌表达的VP1亚单位疫苗，评价模型一般选择小鼠、猕猴等动物。

EV71灭活疫苗通常选择毒力较高的毒株作为疫苗候选株，具有良好的免疫原性及遗传稳定性，并在动物实验中具有交叉保护作用。EV71疫苗原液的免疫原性要显著低于铝佐剂疫苗[45]，目前进入临床的灭活疫苗均使用铝作为疫苗佐剂。Bek等[46]对用C4a亚型毒株制备的2种灭活疫苗进行小鼠攻毒保护研究，结果显示，小鼠接种2种疫苗3~5周后均产生高滴度的 IgG抗体以及针对C4和B3亚型毒株的中和抗体。此外，子鼠可抵御 B3 亚型 EV71 攻击病毒株（MP-26M）的攻击。但部分中和抗体滴度较低的母鼠产生的子代乳鼠也可在攻毒后得以存活，故认为除中和抗体外，体液免疫应答的调节功能在动物保护中也可能发挥了重要作用。Chou等[47]用甲醛溶液灭活的EV71毒株免疫小鼠可引起高水平的病毒特异性抗体，具有交叉中和活性，并保护免疫的宿主对抗病毒EV71在小鼠模型中的致死性攻击。

EV71灭活疫苗在动物实验中具有良好的免疫原性，为临床试验阶段的研究提供了重要的依据。通过杆状病毒表达系统表达的 VLP可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫，对小鼠有一定的保护能力，但是还缺乏VLP 交叉保护的研究[48]。Foo等[49]通过研究EV71的T细胞和B细胞表位，并成功从VP1中鉴定出3个表位，且实验结果证实这3个表位均可以促进CD4+T细胞的分化，产生大量的IL-2和IFN-γ。Lin 等[50]应用制备的 VLP疫苗免疫猕猴，结果显示，VLP疫苗和 EV71 灭活病毒均可诱生大量的抗 EV71 抗体，且均可诱导T 细胞和 B 细胞应答，但VLP 疫苗诱导的中和抗体滴度低于 EV71 灭活病毒组，可能是VLP中VP1的构象与天然病毒有差异。虽然猕猴对EV71疫苗产生抗体反应，与在人类身上观察到的类似，但是它们不适合研究神经毒力和肺水肿并发症，并且它们的使用受到伦理和经济的限制[51]。VP1是中和表位的主要聚集区，具有作为抗病毒亚单位疫苗的潜力，动物实验结果表明此类重组VP1亚单位疫苗具有一定的免疫原性[52-55]，且大肠埃希菌中表达的VP1蛋白融合完全佐剂能在小鼠体内诱导中和抗体效应，增强辅助T细胞增殖，诱导产生高水平的IL-10和IFN-γ，对小鼠有一定保护作用。Liu等[56]研究发现，用EV71截短肽生成的候选融合蛋白疫苗免疫可以保护小鼠免受致命性EV71的感染。以上研究为HFMD安全性疫苗的研发奠定了基础。

5 展望

近年来，关于EV71致病机制及免疫反应方面的研究已经取得了一定进展。这些研究从EV71逃逸干扰素反应、EV71 抑制NF-κB 信号通路、EV71与天然免疫细胞相互作用等方面对EV71与宿主固有免疫系统之间的关系进行了深入剖析。同时，EV71的免疫调控过程也受到宿主RNA表达谱的影响；部分研究还揭示了EV71致病过程中关键的宿主分子或病毒蛋白等靶标，这对疫苗和药物的研发有积极推动作用。

虽然目前对EV71的研究已经取得了很大进展，但EV71感染重症患者的免疫失衡机制以及致弛缓神经系统麻痹机制等问题未完全阐明。展望未来，今后关于EV71的研究热点和方向主要是EV71的致病机制及其与宿主细胞的免疫反应机制，对这些问题的阐释有助于为EV71重症患者有效药物的研发提供理论基础。