重组大肠杆菌全细胞催化合成四氢嘧啶

陈永涛 柯崇榕 杨欣伟 黄建忠

摘 要：四氢嘧啶是天冬氨酸的环状氨基酸衍生物，广泛应用于化妆品、食品、药品等领域。通过比较了5个不同来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，发现从专性嗜碱芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）来源的基因簇整合到大肠杆菌BW25113中后，得到的重组菌pYB1s-BPectABC/BW25113产四氢嘧啶能力最好。利用单因素试验初步优化了pYB1s-BPectABC/BW25113全细胞催化条件： 以100 mmol·L-1天冬氨酸钠和100 mmol·L-1甘油为底物，在100 mmol·L-1 KCl的转化液（pH=7.0）中，30℃下反应24 h，最终四氢嘧啶的产量可达3.10 g·L-1，转化产率达到0.129 g·L-1·h-1。本研究初步得到了四氢嘧啶合成重组菌pYB1s-BPectABC/BW25113，为后续四氢嘧啶的研究奠定了基础。

关键词：四氢嘧啶;全细胞催化;天冬氨酸钠;大肠杆菌;重组

中图分类号：TQ922.2 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）10-0010-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.002

Abstract： Ectoine is a cyclic amino acid derivative of aspartic acid， which is widely used in the fields such as cosmetics， food， medicine and so on. In this paper， by comparing the synthetic gene clusters ectABC of ectoine from five different sources， it was found that the recombinant strain pYB1s-BPectABC/BW25113 obtained from Bacillus pseudofirmus OF4 had the best ability to produce ectoine when it was integrated into Escherichia coli BW25113. The conditions for whole-cell catalysis of pYB1s-BPectABC/BW25113 were preliminarily optimized by single factor experiment： the pYB1s-BPectABC/BW25113 was reacted with 100 mmol·L-1 sodium aspartate and 100 mmol·L-1 glycerine as the substrates in the conversion solution （pH=7.0） of 100 mmol·L-1 KCl for 24 h at 30℃， and the final production of ectoine reached 3.10 g·L-1， and the transformation efficiency reached 0.129 g·L-1·h-1. In this experiment， the ectoine synthetic recombinant strain pYB1s-BPectABC/BW25113 was preliminarily obtained， which laid a foundation for the subsequent researches on ectoine.

Key words： Ectoine;Whole-cell catalysis;Sodium aspartate;Escherichia coli;Recombinant

四氫嘧啶，化学名为1，4，5，6四氢2甲基4嘧啶羧酸，是天冬氨酸的环状氨基酸衍生物[1]。四氢嘧啶广泛存在于嗜盐或耐盐的细菌域或古菌域中，是一种对极端温度、高渗透压和干燥等极端环境具有保护性作用的电解质物质[2]。四氢嘧啶因其独特的保护特性被广泛应用于化妆品、食品及药品等领域，包括防止皮肤老化和细胞损伤的化妆品添加剂[3]，保护蛋白质的稳定剂[4]、PCR反应的增强剂[5]、微生物的干燥保护剂[6]，以及治疗阿尔兹海默症[7]、过敏性鼻炎[8]、特应性皮炎[9]、结肠炎[10]和肺部炎症

[11]等疾病的药物成分。目前四氢嘧啶的交易价格在1000美元·kg-1，是市场上的高价商品[12]。因此，四氢嘧啶成为当下的研究热点之一。四氢嘧啶的生物合成途径最初是在1990年，由Peters等[13]在延长盐单胞菌Halomonas elongata中通过同位素标记以及核磁共振（NMR）方法发现的。它是从合成天冬氨酸家族氨基酸的中心代谢枢纽物质L天冬氨酸β半醛（LASA）开始，由四氢嘧啶3个独特的酶[L2，4二氨基丁酸转氨酶（EctB;EC 2.6.1.76），L2，4二氨基丁酸乙酰转移酶（EctA;EC 2.3.1.178）和四氢嘧啶合成酶（EctC;EC 4.2.1.108）]介导，通过转氨、乙酰化和分子内缩合三步反应合成了四氢嘧啶[13-15]。

当前，四氢嘧啶的生产方法以微生物发酵法为主，微生物发酵法又分为直接发酵法和全细胞催化法[16-17]。直接发酵法生产四氢嘧啶常用的工程菌有嗜盐或耐盐细菌以及异源细菌大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌[18-20]，而全细胞催化法主要使用大肠杆菌[21-22]。与直接发酵法相比，全细胞催化法可以避免嗜盐或耐盐细菌带来的高盐诱导问题，不存在对发酵罐及相关设备的腐蚀，具有反应条件温和的优势;全细胞催化使用大肠杆菌，相比于其他细菌更易于培养和实现产业化[19];此外，全细胞催化法生产四氢嘧啶还具有杂质含量少、产物易于分离纯化、菌体可以重复利用等优点，因此全细胞催化法合成四氢嘧啶近年来备受推崇[22]。本研究拟以价格低廉，易于获得的天冬氨酸钠和甘油为底物，合成高价值的四氢嘧啶。通过以大肠杆菌BW25113为底盘细胞，构建了合成四氢嘧啶的工程菌株，并对该工程菌株的全细胞催化条件进行了优化，获得高产四氢嘧啶的菌株及优化条件，为四氢嘧啶的产业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要试剂 质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;Gibson酶购自NEB（北京）有限公司;胰蛋白胨和酵母提取粉购自英国Oxoid公司;L天冬氨酸、L阿拉伯糖和氢氧化钠购自中国国药集团有限公司;链霉素购自生工（上海）生物工程有限公司;冰醋酸和乙酸钠西陇化工股份有限公司;其余均是分析纯试剂。

1.1.2 质粒、菌株及培养基 质粒pYB1s、菌株大肠杆菌BW25113均来自本实验保藏。LB培养基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g。ZYM自诱导培养基（1 L）：955 mL ZY培养基，20 mL 50×5052，20 mL 50×M，10 mL 20%阿拉伯糖，200 μL 1000×微量元素，200 μL 1 mol·L-1硫酸镁，1 mL链霉素。ZY培养基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g。50×5052（1 L）：25%甘油，2.50%葡萄糖。50×M（1 L）：1.25 mol·L-1磷酸二氢钠，1.25 mol·L-1磷酸二氢钾，2.5 mol·L-1氯化铵，0.25 mol·L-1硫酸钠。1000×微量元素：50 mmol·L-1氯化高铁，20 mmol·L-1氯化钙，10 mmol·L-1氯化锰，10 mmol·L-1硫酸锌，2 mmol·L-1氯化钴，2 mmol·L-1氯化铜，2 mmol·L-1氯化镍，2 mmol·L-1钼酸钠，2 mmol·L-1硼酸。

1.2 仪器与设备

贝克曼J26冷冻离心机购自美国贝克曼有限公司;waters高效液相购自沃特世科技（上海）有限公司;UV1800分光光度计购自日本岛津公司;自动凝胶成像系统JS68D购自上海培清科技有限公司;蛋白电泳仪购自美国Bio-rad公司;恒温培养箱购自上海智诚分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 重组表达质粒的构建 在NCBI上查找得到专性嗜碱芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus OF4、伸长盐单胞菌Halomonas elongata ATCC 33173、施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501、支气管败血波氏杆菌Bordetella bronchiseptica S798、拟态弧菌Vibrio mimicus SCCF01等5株菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC序列，委托上海生物工程公司进行合成，通过Gibson酶将目的基因与质粒pYB1s连接构建5个重组质粒，分别转化到大肠杆菌BW25113感受态细胞中，获得pYB1s-BPectABC/BW25113（ectABC基因簇来源于B.pseudofirmus）、pYB1s-HEectABC/BW25113（ectABC基因簇来源于H.elongata）、pYB1s-PSectABC/BW25113（ectABC基因簇来源于P.stutzeri）、pYB1s-BBectABC/BW25113（ectABC基因簇来源于B.bronchiseptica）和pYB1s-VMectABC/BW25113（ectABC基因簇来源于V.mimicus）5株重组菌。

1.3.2 目的基因的诱导表达 挑单菌落于5 mL LB液体培养基中37℃、220 r·min-1培养8～9 h，再按1%接菌量转接至ZYM自诱导培养基中，30℃、220 r·min-1自诱导培养18 h。以菌体（OD600 nm=10）经0.9%氯化钠洗涤2次后破碎离心，取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.3.3 全细胞催化 自诱导18 h后，通过在8000 r·min-1离心5 min收集菌体，用0.9%氯化钠溶液洗涤2次，然后再悬浮在含有100 mmol·L-1磷酸钠缓冲液（pH 7.0）、50 mmol·L-1天冬氨酸钠、100 mmol·L-1 KCl和100 mmol·L-1甘油的反应转化液中，形成细胞悬浮液（OD600 nm=10）。使用50 mL三角瓶中装10 mL细胞悬浮液在30℃，220 r·min-1，进行催化试验，分别取0、3、6、9、21、24 h的转化液1 mL，12000 r·min-1离心1 min，取上清用0.22 μm滤膜过滤完待液相检测（设置3组平行试验）。

1.3.4 全细胞催化体系的优化 為了优化转化液的组分，在全细胞催化试验中比较了不同浓度的天冬氨酸钠 （50、100、150、200和300 mmol·L-1）对四氢嘧啶生产的影响，获得最适天冬氨酸钠浓度之后，在最适的天冬氨酸钠浓度下，比较了不同浓度的甘油（50、100、150、200和300 mmol·L-1），以及KCl （0、50、100、200和300 mmol·L-1）对四氢嘧啶生产的影响;为了评估温度对四氢嘧啶生产的影响，分别在25、30、35、40、45℃下pH 7.0时进行催化试验;为了评估pH的影响，将反应转化液调节至pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，并在30℃进行催化试验（设置3组平行试验）。

1.3.5 四氢嘧啶的检测方法 四氢嘧啶检测采用XBridge Amide色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），检测波长为210 nm，柱温40℃，流速0.8 mL·min-1，流动相配比为75%乙腈和25%甲酸水（含0.1%甲酸）。

2 结果与分析

2.1 目的基因的表达

5株重组大肠杆菌经SDS-PAGE分析，结果见图1。在5株重组大肠杆菌中，EctA的条带在20 kDa左右，EctB的条带在44 kDa 左右，EctC的条带在18 kDa 左右，SDS-PAGE结果与B.pseudofirmus、H.elongata、P.stutzeri、B.bronchiseptica、V.mimicus预测的EctA、EctB和EctC分子质量大小非常相近。此外，通过比较上清液与沉淀，可知上清液中蛋白条带非常明显，而沉淀中蛋白条带不明显，说明大部分蛋白都是可溶性蛋白，此外，也可分析出重组pYB1s-BPectABC/BW25113的EctB表达最好。试验结果表明了四氢嘧啶合成基因成功在大肠杆菌BW25113中表达。

2.2 重组大肠杆菌BW25113的筛选

5株重组菌在50 mmol·L-1天冬氨酸钠、100 mmol·L-1甘油和100 mmol·L-1 KCl的100 mmol·L-1磷酸钠缓冲液（pH 7.0）转化液中，在温度30℃下进行全细胞催化24 h，结果如图2。

如图2所示，重组大肠杆菌pYB1s-BPectABC/BW25113、pYB1s-HEectABC/BW25113、 pYB1s-PSectABC/BW25113、pYB1s-BBectABC/BW25113和pYB1s-VMectABC/BW25113催化24 h四氢嘧啶产量分别为1.79、1.41、0.21、0.92、0.78 g·L-1，结果表明不同来源的ectABC簇构建的工程菌株生产四氢嘧啶，产量之间有显著的差异，其中，重组大肠杆菌pYB1s-BPectABC/BW25113表现出最高的转化效率（0.074 g·L-1·h-1）和四氢嘧啶产量（1.79 g·L-1）。因此，选择最高产量的pYB1s-BPectABC/BW25113作为产四氢嘧啶的出发菌株，进一步优化其产四氢嘧啶的反应条件。

2.3 全细胞催化体系的优化

2.3.1 天冬氨酸钠对四氢嘧啶产量的影响 天冬氨酸钠是四氢嘧啶合成的底物，其浓度影响四氢嘧啶产量的因素之一。因此，首先考察了不同浓度的天冬氨酸钠对合成四氢嘧啶的影响。如图3所示，随着天冬氨酸钠浓度的提高，四氢嘧啶产量呈现出先升高后降低的趋势。天冬氨酸钠为100 mmol·L-1时，四氢嘧啶产量最高，为3.06 g·L-1， 提高天冬氨酸钠浓度到150、200 mmol·L-1时，四氢嘧啶产量没有进一步提高，当天冬氨酸钠浓度为300 mmol·L-1时，仅有1.57 g·L-1四氢嘧啶产生。因此，最佳的天冬氨酸钠浓度为100 mmol·L-1。

2.3.2 甘油对四氢嘧啶产量的影响 甘油可以为EctA催化中乙酰辅酶A的产生提供底物和能量，是影响四氢嘧啶合成的因素之一。因此，进一步考察了甘油对合成四氢嘧啶的影響。如图4所示，随着甘油浓度的提高，四氢嘧啶产量呈现先升高再趋于平稳后降低的趋势。甘油为100 mmol·L-1和150 mmol·L-1时，四氢嘧啶产量最高，约为3.08 g·L-1， 提高甘油浓度到200 mmol·L-1以上时，四氢嘧啶产量下降，进一步提高甘油浓度为300 mmol·L-1时，仅有1.61 g·L-1四氢嘧啶产生。因此，最佳的甘油浓度为100 mmol·L-1。

2.3.3 KCl对四氢嘧啶产量的影响 KCl具有稳定EctB活性的作用，为了解KCl对四氢嘧啶产量的影响，试验考察了不同浓度的KCl对合成四氢嘧啶的影响。如图5所示，随着KCl浓度的提高，四氢嘧啶产量呈现先升高后降低的趋势。在KCl浓度为100 mmol·L-1，此时四氢嘧啶产量达到最大3.07 g·L-1，当不存在KCl时或在较高的KCl浓度（300 mmol·L-1）下，四氢嘧啶产量显著降低。因此，最佳的KCl浓度为100 mmol·L-1。

2.3.4 温度对四氢嘧啶产量的影响 温度是影响酶活性的重要因素之一，因此试验考察了温度对合成四氢嘧啶的影响。如图6所示，随着温度的提高，四氢嘧啶产量呈现先升高再趋于平稳后下降趋势。温度的最适范围是30～35℃，在此温度范围内，可以催化合成四氢嘧啶约3.08 g·L-1。当温度高于40℃后产量急剧下降，45℃时四氢嘧啶产量仅为1.27 g·L-1。因此，为了节约成本，最佳温度为30℃。

2.3.5 pH对四氢嘧啶产量的影响 除温度外，pH也是影响酶活性的重要因素之一，因此试验考察了pH对合成四氢嘧啶的影响。如图7所示，随着pH的提高，四氢嘧啶产量呈现先升高后降低的趋势。当pH为7.0，此时四氢嘧啶产量达到最高（3.10 g·L-1）。然而当pH高于7.5后产量急剧下降，pH为8.0时，四氢嘧啶产量仅为1.89 g·L-1。因此，最佳pH为7.0。

3 结论与讨论

四氢嘧啶的合成途径在多种好氧异养细菌中都存在，如盐红酵母属、盐单胞菌属、嗜色盐杆菌属、弧菌属、γ蛋白细菌类假单胞菌，甚至古生菌亚硝基藻或嗜碱甲氧菌等[18，23-24]。本研究以大肠杆菌BW25113为底盘细胞构建了5株四氢嘧啶合成菌株，并从中筛选出具有四氢嘧啶合成能力的工程菌株pYB1s-BPectABC/BW25113，其ectABC基因簇来源于Bacillus pseudofirmus OF4。为进一步提高四氢嘧啶的产量，本研究利用单因素试验探讨了天冬氨酸钠浓度、甘油浓度、KCl浓度、催化温度及pH等反应因素对四氢嘧啶产量的影响，最终在100 mmol·L-1天冬氨酸钠、100 mmol·L-1甘油和100 mmol·L-1 KCl转化液中，反应温度为30℃，反应pH 为7.0，反应24 h，四氢嘧啶的产量可达3.10 g·L-1，转化产率达到0.129 g·L-1·h-1。经初步优化后，pYB1s-BPectABC/BW25113催化合成四氢嘧啶的转化效率比优化前提高1.73倍，表明优化反应条件能够提高四氢嘧啶的产量。本研究为产四氢嘧啶工程菌的进一步代谢工程改造和实现产业化奠定基础。但是仍然存在一些问题需要解决和研究，如EctA、EctB和EctC 3种蛋白表达量存在明显差异，是否是限制四氢嘧啶产量提高的重要因素之一;重组菌pYB1s-BPectABC/BW25113的表达及四氢嘧啶的转化等未进行放大试验;四氢嘧啶的分离纯化等也未研究。

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（責任编辑：柯文辉）