屏障设施条件下控制大鼠感染仙台病毒的措施

乔彦华，姚紫彤，孙 泉，陈柏安，卢 静

(首都医科大学实验动物部，北京 丰台 100069)

实验动物在生命科学研究中应用广泛，实验动物的质量直接决定着生命科学研究结果的准确性和可靠性。而病原微生物是影响实验动物质量的重要因素之一。仙台病毒(Sendai virus,SV)是啮齿类动物最难控制的病毒之一，传染性强且容易扩散。大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠在自然条件下均可感染，大鼠感染仙台病毒多数呈亚临床经过，有时可引起肺炎，对使用大鼠进行的麻醉实验和吸入毒理学研究等均可产生严重干扰[1]。

本试验以屏障设施条件下大鼠感染仙台病毒为例，重点从垫料及饲养盒、隔离服、饮水瓶等物品的高压灭菌、饲料的灭菌、动物饮用水的净化、动物的引进、人员管理、空调设备维护等方面分析感染原因并提出相应的防控措施，为生命科学研究提供高质量的实验动物。

1 材料与方法

1.1 试验耗材 121 ℃压力蒸汽灭菌化学指示卡(四环生物)，3M嗜热脂肪杆菌芽孢菌(3M公司)；直径90 mm一次性灭菌琼脂培养皿(国药科兴化工产品有限公司)。

1.2 检测方法

1.2.1 大鼠仙台病毒检测 2018年5月，随机抽取4个小鼠饲养间哨兵鼠共10只(品系为ICR)、 3个大鼠饲养间哨兵鼠共10只(品系为SD)进行实验动物微生物质量抽检，检测单位为中国食品药品检定研究院，检测项目及方法按国标(GB 14922.2-2011 实验动物微生物学等级及监测)进行。

1.2.2 垫料及饲养盒、饮水瓶及隔离服灭菌方法及微生物检测 使用双扉脉动真空灭菌器进行高压湿热灭菌，灭菌程序为脉动3次、121 ℃ 灭菌30 min、干燥30 min。对灭菌后储存在洁物间3 d的垫料及饲养盒、饮水瓶、隔离服分别进行取样检测，具体如下：随机抽取3盒垫料(垫料在饲养盒内)，每盒垫料不同部位混合取50 g放入灭菌瓶内，在无菌操作台内将垫料样本放入灭菌的装有适量蒸馏水的锥形瓶中，用灭菌玻璃棒搅拌使其充分溶解，静置30 min后，用灭菌吸管吸取1 mL注入一次性琼脂平皿，37 ℃培养48 h，观察菌落生长情况。随机抽取3套隔离服及3个饮水瓶，使用无菌棉签蘸取灭菌水在隔离服上涂抹5 cm×5 cm大小面积，每1套隔离服取样3个点。使用无菌棉签蘸取灭菌水在饮水瓶内部涂抹5 cm×5 cm大小面积，将涂抹后的棉签接种于营养琼脂平板，37 ℃培养48 h，观察菌落生长情况。

1.2.3 饲料灭菌方法及微生物检测 购买经Co60照射灭菌的全价颗粒饲料，由非洁净区人员用0.5%～2%过氧乙酸喷雾消毒后，码放在传递仓内，再经紫外线消毒20 min后进入洁物间。随机抽取3袋洁物间内饲料，对同一袋饲料用灭菌镊子上、中、下3个部位混合取样，放入灭菌瓶中，在无菌操作台内将饲料样本放入灭菌的装有适量蒸馏水的锥形瓶中，用灭菌玻璃棒搅拌使其充分溶散，静置30 min后用灭菌吸管吸取1 mL注入一次性琼脂平皿，37 ℃培养48 h，观察菌落生长情况。

1.2.4 动物饮水灭菌方法及微生物检测 动物饮用水由纯水系统净化灭菌后用饮水瓶取用，每季度监测1次饮水微生物情况，检测时用灭菌容器从水龙头处取1～2 mL动物饮用水，在无菌操作台内接种于一次性琼脂平皿中。置于37 ℃培养48 h后，观察菌落生长情况。

2 结果

2.1 大鼠仙台病毒检测 2018年5月，将随机抽取的10只ICR小鼠及10只SD大鼠送至中国食品药品检定研究院按国标要求进行SPF级别微生物检测。结果显示，10只小鼠微生物检测结果均为阴性，10只SD大鼠微生物检测结果见表1，其中3只大鼠仙台病毒检测为阳性，均来自同一个饲养间。

表1 大鼠微生物学检测

2.2 垫料及饲养盒、饮水瓶、隔离服微生物检测 为了检测高压灭菌效果，对洁物间储存3 d的垫料、饮水瓶及隔离服分别取样进行微生物培养，结果显示，菌落总数均为0(表2)。

表2 垫料、饮水瓶及隔离服微生物检测

2.3 饲料灭菌效果检测 为了检测饲料的灭菌效果，随机抽取洁物间3袋饲料，每袋饲料分别从上、中、下3个部位混合取样，微生物培养48 h后，3袋饲料菌落总数均为0，说明饲料灭菌效果符合要求。

2.4 饮水灭菌效果检测 按国标要求，实验动物饮用水需为无菌水。从洁净区水龙头取饮水1～2 mL，经微生物培养后观察，菌落数为0 CFU/皿(表3)，符合要求。

表3 2018年屏障设施动物饮水微生物检测

3 讨论

屏障设施条件下能够感染大、小鼠的病原微生物有很多，有些病原会引起暴发流行，甚至毁灭整个动物群，有些人兽共患病原会威胁人类健康，还有些病原虽然不会引起明显的临床症状，但会对科研工作产生严重干扰，如小鼠肝炎病毒、仙台病毒、鼠支原体等。

世界各地大、小鼠携带仙台病毒的现象非常普遍。尤其是近10多年来，我国实验大、小鼠中检出仙台病毒感染的鼠群数量和样品阳性率呈上升趋势，2013年阳性率高达15.87%[2]。王翠娥等对2012-2013年国内多家单位送检的大小鼠血清进行检测，发现大、小鼠仙台病毒均有较高的阳性率(8.3%、14.0 %)[3]。屏障设施内动物一旦感染仙台病毒，需要及时隔离感染房间，淘汰鼠群，或通过胚胎移植方式重建鼠群。

屏障设施动物微生物感染的原因有很多，有时为单一因素造成，更多时候是多种因素相互关联、共同作用的结果[4]。因此，病原微生物的防控也必须多管齐下，主要从以下三方面入手：人流(人员管理及规章制度制定)、物流(进入屏障物品的灭菌及引进动物的隔离检疫)、气流(设施内环境空气洁净度及空调净化设备的维护)。

刘艳等对我国1980-2010年实验动物屏障设施感染事件分析发现，工作人员的操作不当和失误等人为因素是引起实验动物设施感染事件发生的主要原因[5]。因此，建议制作详细的标准操作规程并加强人员培训，人员进出不同房间时更换一次性PPE(手套、口罩、帽子)，更换垫料最好在生物安全柜内进行，防止气溶胶产生。

外界病原微生物可能通过未经灭菌或灭菌不彻底的物品进入屏障。因此，笔者对洁物间储存了3 d的垫料、隔离服、饮水瓶及饲料、动物饮用水进行了微生物培养，结果显示均无微生物污染。为了保证灭菌效果，建议每次灭菌时除使用化学指示卡外，应定期使用生物指示剂进行监测[6]。灭菌器由有资质的专业人员进行管理和维护，建立设备管理档案，定期进行仪器维护和检查。物品尽量随灭随用，避免二次污染，物品在洁物间储存最多不超过3 d[7]。

新引进动物的隐性感染是屏障设施微生物污染的主要原因之一。文中仙台病毒阳性大鼠所在的饲养间在1个月前有引进动物记录，且该房间大鼠在此前和此后的定期微生物监测(每季度一次)中均未发现感染仙台病毒。因此，本次仙台病毒极有可能来源于此批新引进的动物。由此建议引进新动物时，都要严格进行隔离检疫或生物净化；购买动物时选择有生产许可证的大型动物供应商，接收动物时仔细检查包装盒，包装破损的动物不得进入屏障。

屏障设施通过空调净化系统将温度、湿度、风量、换气次数和空气洁净度等内环境指标控制在国标规定的范围内。内环境的稳定对于微生物控制非常重要。王晶等的研究表明，饲养活动可使屏障内落下菌与尘埃粒子数明显升高，饲养结束后喷雾消毒可使屏障内落下菌与尘埃粒子数明显下降[8]。刘香梅等通过研究发现，屏障设施由于部分高效过滤器密封不好,导致外界微生物随气流进入屏障设施内。由于高效过滤器发生堵塞,致使换气次数减少,压差紊乱,气体发生倒流,最终使屏障设施内空气遭受污染[9]。因此，建议加强对屏障设施内环境的维持性消毒，定期监测落下菌及尘埃粒子数，定期更换空调过滤器。

除了从人流、物流、气流三方面切断病原微生物进入屏障设施的途径外，应定期对实验动物进行微生物学监测，目前，国内外检测机构多采用血清学检测方法[10]。但由于ELISA试剂盒不同批次、操作人员及仪器存在差异等原因，检测结果会出现假阳性和假阴性现象。因此，针对阳性结果，建议更换实验室或试剂盒进行复核。或用ELISA和IFA法进行比对检测，可降低假阳性和假阴性结果的出现率[11]。