H7N9亚型禽流感油乳灭活疫苗诱导鸡鸭鹅产生HI抗体的试验

张济培，曹梦蕊，张溢珊，李荣旭，刘佑明，刘敏芳，陈济铛，陈建红

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231)

自2013年我国首次出现H7N9新型禽流感病毒以来，H7N9亚型禽流感在我国多地出现流行，随着病毒的进化，病毒从对禽表现为不致病或低致病性转变为高致病性，2017年3月，湖南地区出现由高致病性H7N9亚型禽流感病毒引起大量鸡死亡的病例[1]。此外，据报道，H7N9亚型禽流感病毒可以直接感染人[2-3]。可见控制H7N9亚型禽流感病毒的流行对保护禽类健康和保障公共卫生安全具有双重意义。目前H7N9亚型禽流感疫苗正处在应用推广阶段，为了有效防控H7N9亚型禽流感，本试验采用H7N9亚型流感灭活疫苗，对雏鸡、雏番鸭和雏鹅3种有代表性的禽种，进行3种程序的免疫试验，检测HI抗体变化情况，企望了解本疫苗对该几种禽的免疫原性，及筛选出适合该禽类的免疫剂量、免疫次数等指标，为H7N9亚型流感灭活疫苗的应用提供具体的参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄非免疫雏鸡(下简称C)，购自佛山市高明区某种鸡养殖场；1日龄非免疫番鸭(下简称DF)，购自佛山市顺德区某种番鸭养殖场；1日龄非免疫鹅(下简称G)，购自肇庆市高要区某种鹅养殖场。所有雏禽严格隔离饲养至2周龄，待试。

1.2 试剂器材 H7N9亚型禽流感油乳灭活疫苗(下简称H7N9油苗)及其HI抗原，由华南农业大学禽病实验室提供；pH值7.2的0.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水，1%公番鸭红细胞悬液，1%公鸡红细胞悬液，按常规配制。

1.3 方法

1.3.1 试验动物分组与处理 2周(14日)龄雏鸡44只，随机分成C1、C2、C3、C4共4组，11只/组。C1-C3组采用H7N9油苗肌肉注射接种，其中C1组为“2周龄0.3 mL /只”免疫组(免疫程序1)；C2组为“2周龄0.5 mL /只”免疫组(免疫程序2)；C3组为“2周龄0.3 mL/只，3周龄0.6 mL/只”免疫组(免疫程序3)；C4组为非免疫组。各组分别于接种前(接种当天)和接种后每周经静脉采血，分离血清标记，-20 ℃保存，统一按常规做H7N9亚型流感HI抗体效价检测。2周龄雏番鸭44只，2周龄雏鹅44只，其分组、免疫接种及采血安排与上述雏鸡一致。

1.3.2 各种雏禽H7N9亚型流感HI抗体检测方法 血凝抑制试验(HI)微量法，参照《高致病性禽流感疫情处置技术规范(试行)(2004)》及朱燕秋等“水禽禽流感 H5N1 抗体检测方法”进行[4-5]。对鸡的血清，采用1%成年公鸡源红细胞悬浮液作 HI 试验；对番鸭和鹅的血清，采用1%成年公番鸭源红细胞悬浮液作 HI 试验。

2 结果

2.1 各种雏禽各组H7亚型流感HI抗体检测情况 见表1。

表1 各种雏禽各组H7N9亚型禽流感 HI 抗体(Log2)检测情况及各周(W)均值

2.2 雏鸡各组H7N9亚型禽流感HI抗体比较的情况 由表1中C1-C3组H7N9亚型禽流感HI抗体检测结果可见，雏鸡应用 H7N9 油苗，采取3种方式免疫，免疫后各周均值以 C1 组最低(3.66 Log2)，最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C2 组各周 HI 抗体均值中等(4.09 Log2)，仍然是最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C3 组各周 HI 抗体均值最高(4.46 Log2)，只有最初1周低于4.00 Log2。

2.3 雏番鸭各组H7N9亚型禽流感HI抗体比较情况 由表1中DF1-DF3组H7N9亚型禽流感HI抗体检测结果可见，雏番鸭应用 H7N9 油苗，采取3种方式免疫，免疫后各周均值以 DF1 组最低(4.96 Log2)，DF2 组、DF3 组各周 HI 抗体均值相近(6.37 Log2，6.31 Log2)，显著高于DF1 组。另外可见，3组均只有免疫后最初1周低于4.00 Log2。

2.4 雏鹅各组H7N9亚型禽流感HI抗体比较的情况 由表1中G1-G3组H7N9亚型禽流感HI抗体检测结果可见，雏鹅应用 H7N9 油苗，采取3种方式免疫，免疫后各周均值以 G1 组最低(4.44 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G2 组各周 HI 抗体均值中等(5.02 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G3 组各周 HI 抗体均值最高(5.60 Log2)，最初2周低于4.00 Log2。

2.5 各种雏禽同方式免疫组H7亚型禽流感HI抗体比较情况 由表1可见，以免疫程序1接种H7N9油苗，HI 抗体产生情况最好的是番鸭(抗体水平上升较快，峰值平稳维持时间较长)；次之为雏鹅(抗体水平上升较慢，但持续维持上升状态)，再次为雏鸡(抗体水平上升较慢，峰值维持时间较短)。

由表1可见，以免疫程序2接种H7N9油苗，HI抗体产生情况最好的是番鸭(抗体水平上升快速，并呈持续上升趋势)；次之为雏鹅(抗体水平上升较慢，各周均低于雏番鸭，但有持续上升趋势)，再次为雏鸡(抗体水平上升较慢，峰值维持时间较短)。

由表1可见，以免疫程序3接种 H7N9油苗，以雏番鸭产生的HI 抗体较好；次之为雏鹅，再次为雏鸡。

2.6 各种雏禽各免疫组H7N9亚型禽流感HI抗体均值比较情况 由表1可见，以各种雏禽各免疫组抗体均值作比较，进一步显示，以 H7N9 油苗免疫诱导 HI 抗体反应，最好为雏番鸭，其次为雏鹅，再次为雏鸡；免疫接种方式，雏鸡和雏鹅，以3组优于2组，2组优于1组；雏番鸭，以3组、2组免疫效果较好而优于1组。

3 讨论

自2017年3月份在湖南永州发生H7N9亚型禽流感后，陆续报道在河北、河南、天津、陕西等地发生H7N9亚型禽流感疫情，引起大量鸡只死亡，造成经济损失[6]。同时，H7N9亚型禽流感于2013年首次报道感染人以来，波及范围不断扩大，造成全国多地区人感染发病、死亡[7]。可见H7N9亚型禽流感病毒不仅在动物经济方面造成影响，且对人类健康也存在威胁，因此加强H7N9禽流感的防控具有深刻的意义。

本试验采用H7N9油乳灭活疫苗，对雏鸡、雏番鸭和雏鹅进行免疫试验。结果表明，本疫苗对3种雏禽都具有良好的免疫原性。但禽的品种不同，接种剂量及次数不同，诱导产生HI抗体的强度亦有不同。据各种雏禽各免疫组抗体均值作总体评价，反应效果最好为雏番鸭，其次为雏鹅，再次为雏鸡；同种禽类不同程序之间评价，在雏鸡和雏鹅，以程序3优于程序2，程序2优于程序1；在雏番鸭，以程序3与程序2较好，优于程序1。

雏鸡免疫2周后HI抗体达到4.00 Log2，免疫后各周均值可达4.46 Log2；雏番鸭免疫2周后HI 抗体达到4.91 Log2，免疫后各周均值可达到6.37 Log2；雏鹅免疫3周后HI 抗体达到4.55 Log2，免疫后各周均值可达到5.60 Log2。张济培等[8]在番鸭作H5N1亚型禽流感的免疫保护试验，在人工感染的情况下，表明HI抗体在4 Log2时，大部分番鸭可以抵抗病毒感染，小部分仍然有发病，HI抗体在6 Log2或以上时，所有番鸭均可抵抗病毒感染。姜北宇等[9]也报道，采用H5亚型禽流感疫苗免疫，当抗体HI≥6 Log2时，保护率达100%，免疫动物能抵御禽流感强毒的攻击。提示，如果以4 Log2为免疫保护临界滴度，则为了使免疫雏禽获得尽可能好的保护，对于雏鸡和雏鹅应采用程序3免疫接种，对于雏番鸭，则可优先选用程序3和程序2。不同品种、不同用途的家禽可根据饲养时间的不同，选取适合的免疫程序。可以根据对免疫禽群的免疫监测动态结果，来适当调整免疫程序。