蔗田污染物过硫酸铵和甲胺磷的快速精准检测方法探讨

赵欢欢，付建涛，毛玉玲，黄卫娟*

(1广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所) 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2广东省药肥工程技术研究中心，广东广州510316)

0 引言

甘蔗是广西、云南等地区的主要经济作物之一，是当地经济发展的重要支柱和蔗农的主要经济来源，而蔗田农药残留和土壤重金属污染是制约甘蔗产业发展的重要因素。甘蔗生长过程中深受病虫草害影响，目前防治病虫草害多使用化学药剂，且多数化学药剂有一定的生物蓄积作用，对哺乳动物、鸟类及水生无脊椎动物有毒性作用。农药化肥污染已成为土壤污染中面积最大、危害最大的环境污染之一，受到了社会的广泛关注。

积极寻找蔗田农药、化肥残留污染的有效快速检测手段显得尤为重要。目前，土壤污染物检测方法虽然较多，包括光学检测方法、电化学检测法、生物学相关检测法以及气相、液相色谱法等[1]。然而现有的检测仪器报价昂贵、样品预处理程序复杂，不仅耗时费力耗钱，也限制了在基层农业企业中的使用。

近年来，国内学者采用微核技术检测具有诱变性的污水、化学药品、农药等。蚕豆(Vicia f aba)作为一种理想的细胞遗传学研究材料。蚕豆的染色体大，数量少(2n=12)，根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验[2]。相较之下，甘蔗根系生长缓慢，实验周期长，且为多倍体，染色体数量因品种不同而差异较大，用甘蔗自身材料来检测蔗田污染物的效果预见性不够强，不如蚕豆根尖的检测灵敏度高。

早在1959年，放射生物学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究[2]。到了70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟，作为一种检测化学品遗传学毒性的方法为人们所知[3]。蚕豆根尖微(Micronucleus，MCN)技术[4]不仅具有简便、快捷、重复性好和灵敏度高的优势，而且其检测结果与动物试验结果具有很高的一致性[5]。因此，1986年蚕豆根尖微核试验被我国环保局列为水环境生物测试的规范方法，用于检测水体的致突变性[6]。

用微核来评价污染物、有毒物质、药物对体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观可行的方法[7-8]。然而，对农田土壤污染物的检测虽有研究报道，但仍需要更多的普及应用。本文采用蚕豆根尖微核试验对蔗田污染物包括过硫酸铵以及农药甲胺磷的诱变能力进行检测，分别研究两者对蚕豆根尖细胞的诱变能力，以期为检测蔗田污染物提供参考，为农业生产上安全合理使用农药和污染治理提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料的来源和培养

实验用的蚕豆种子来源于芜湖种子市场，实验室内温度为(10±5)℃，自然光照条件下培养24 h后，再置于恒温箱内培养24 h，使用蒸馏水培养。

1.2 实验用具和仪器准备

实验使用的仪器用具有：烧杯、EP管、玻璃棒、量筒、移液管、盖玻片、载玻片、镊子、剪刀、胶头滴管、白瓷盘、纱布、水浴锅、恒温箱、显微镜等。

1.3 实验设计和操作步骤

1.3.1 浸种、催芽

选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子洗净后，放入盛有蒸馏水的烧杯中，25℃下浸泡24 h，期间换水2次。待种子吸胀后，放入用蒸馏水浸湿纱布铺垫的白瓷盘中水培24 h，于室温下催芽48 h再移至恒温箱中培养24 h，至初生根长至2 cm左右。

1.3.2 染毒

用蒸馏水将过硫酸铵配制成8种不同浓度，分别是 10000、5000、1000、500、100、10、1、0.1 mg/L。对农药甲胺磷用蒸馏水稀释配置成6种浓度，分别是 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L。另设蒸馏水做对照。选取发育良好，根的长度约为1～2 cm的蚕豆幼苗，将幼苗分别放入装有不同浓度甲胺磷和过硫酸铵溶液的EP管中并对各管做标记，染毒处理24 h。同时用蒸馏水设立空白对照组。

1.3.3 固定、保存

切下0.5～1 cm长的乳白色幼根放入对应编号的试管，向各试管中加入新配制的卡诺氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h。然后用蒸馏水清洗根尖后，再放入70%酒精中保存备用(保存时间不超过2 个月)。

1.3.4 解离

从固定液中取出蚕豆根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1 mol/L HCl中，在60℃水浴中处理8 min，使根尖软化。

1.3.5 染色和压片

取处理好的根尖用蒸馏水漂洗数次后，置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1～2滴改良的碱性品红染色5 min，进行常规压片。

1.3.6 镜检

每组各取3～5个根尖在高倍镜下观察，每个根尖至少观察500～1000个细胞，并记录发生微核的细胞数。

1.4 统计参数[9]

微核千分率 MCN‰=(出现微核的细胞数/计数的细胞总数)×1000‰。数据采用SPSS软件进行统计分析并作图。

1.5 微核计数标准[10]

微核染色体的结构和颜色深浅同主核相似。转动微调时，与主核处于同一水平面；圆形或卵圆形，界限清楚，包含于胞浆中，直径小于主核的1/3，并与主核不相连；微核完整，不重叠，但死亡或降解的细胞除外。

2 结果与分析

2.1 过硫酸铵处理对MCN‰的影响

蚕豆根尖各个处理的微核千分率(MCN‰)见表1。通过表中数据发现，过硫酸铵浓度在100～1000 mg/L时，不同处理组之间的微核千分率(MCN‰)有着显著差异(P＜0.05)；过硫酸铵浓度在 100～5000 mg/L时，不同处理组与对照组相比有着显著差异(P＜0.05)，而当过硫酸铵浓度达到10000 mg/L，则与对照组无显著差异。从表1和图1中也可以看出，随着过硫酸铵浓度从0增加至500 mg/L时，MCN‰也在上升，表明过硫酸铵对蚕豆根尖细胞的毒害作用增强；但是，当浓度从500 mg/L增加到1000 mg/L时，MCN‰则开始下降，降低为10.69‰，随着浓度进一步增加至10000 mg/L时，MCN‰减少至仅为4.78‰。

除此以外，研究发现在出现微核的细胞中，微核的数量也是不同的，有1～2个，甚至有的细胞有多个微核出现。在对照组中常不超过5个微核，而处理组细胞中微核多在10个以上，说明低浓度过硫酸铵对蚕豆根尖细胞足以产生较强的诱变性和毒性。同时发现蚕豆根尖细胞有丝分裂受到不同程度的阻碍，表明在低浓度下过硫酸铵已经对蚕豆根尖细胞的生长造成了损害。

2.2 过硫酸铵处理蚕豆根尖细胞后的微核现象

表1 染毒24 h后不同浓度过硫酸铵对蚕豆根尖微核千分率(MCN‰)的影响

过硫酸铵处理蚕豆根尖细胞可诱导产生微核，细胞内出现单微核、双微核以及三微核等，且在蚕豆根尖细胞有丝分裂各时相中均能观察到微核。在10～1000 mg/L浓度范围内设定几个浓度梯度，利用微核检测进一步检验此浓度范围内过硫酸铵对蚕豆根尖的诱变影响的具体变化，发现500 mg/L过硫酸铵浓度影响下，微核总数达到最高值，为过硫酸铵对蚕豆根尖的最佳诱变浓度(图1)。同时，经高浓度过硫酸铵(≥100 mg/L)的诱变，显微镜下还能明显观察到染色体畸变，如染色体丢失、染色体断片、染色体滞后等现象，说明过硫酸铵处理对蚕豆根尖细胞遗传物质造成不同程度的损伤。

图1 不同浓度过硫酸铵对蚕豆根尖细胞的影响

2.3 蔗田农药污染物甲胺磷对蚕豆根尖细胞微核的诱变效应

已有较多研究报道了农田杀虫剂、除草剂等农药对蚕豆根尖细胞有较强的遗传毒性。本文以防治甘蔗绵蚜常用的甲胺磷为研究对象，基于蚕豆根尖微核试验的测定手段，判断其对植物细胞诱变的遗传毒性。从图2可以看出，随着处理液浓度的增加，蚕豆根尖细胞MCN‰逐步上升，尤其浓度大于0.2 g/L之后，根尖微核率快速增加，诱变作用也迅速增强。进而表明高浓度的农药有很强的诱变效应，浓度越高，毒性越大，造成的遗传损伤也越严重。

3 讨论

图2 甲胺磷对蚕豆根尖细胞微核的诱变效应

本实验结果表明高浓度的过硫酸铵和甲胺磷对蚕豆根尖具有较高的诱变性能，其遗传毒害可在细胞分裂期间DNA和染色体的复制合成过程中产生，并以微核形式显示[11]。各实验处理组和对照组的比较则表明高浓度的过硫酸铵和甲胺磷会严重阻碍根尖细胞分裂，其MCN‰和对照组差异不显著，而能保证细胞具有一定程度分裂水平的处理组和对照组则差异显著。

甘蔗生长周期长，易受到多种病、虫、草、鼠等有害生物的为害等特点。除了本研究的两种污染物之外，甘蔗生产上长期使用高毒农药、化学肥料和除草剂等，包括呋喃丹、甲拌磷、特丁硫磷、甲基异柳磷、莠去津、乙草胺、二甲吩草胺等[12-13]，造成土壤环境的污染，仍缺乏快速便捷的检测方法，有待微核检测技术的应用。

由于环境污染会引起植物细胞内染色体畸变而形成微核，相对于蚕豆，甘蔗生根较慢，且对蔗田污染物具有一定的耐受性，不宜作为细胞微核检测的优良材料。而蚕豆根尖生长迅速，对环境诱变剂敏感度较高，且染色体数量相对甘蔗较少，易于染色显微观察，为蔗区污染物提供了新的检测技术参考。因此，通过蚕豆细胞微核的致畸程度，预测蔗田污染物对甘蔗生长的危害具有一定的参考意义。