不同pH条件下阴沟肠杆菌ODC基因的表达调控研究

赵轩，范亚红，刘利利，刘秀，叶竟雯，盛晓钰，刘琼馨

（1.长春师范大学生命科学学院，吉林长春130024；2.长春市九台区营城第一高级中学，吉林长春130000）

阴沟肠杆菌为革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤中，是植物根系的联合固氮菌。多项研究表明，联合使用该菌具有降解农药等环境污染物、提高农作物产量的作用[1-4]。

多胺参与细菌的多种应激反应[5-7]，相关研究表明细菌在酸性条件下，通过控制转录与翻译过程诱导产生与多胺合成相关的酶，并进一步诱导产生多胺以适应酸性条件[8-9]。本研究在不同酸碱条件下培养阴沟肠杆菌，检测不同条件培养液中腐胺含量及ODC基因的表达调控，为进一步分析阴沟肠杆菌产多胺机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

阴沟肠杆菌，由本实验室筛选、保存。

1.2 试剂

ODC探针由北京鼎国生物技术有限公司合成，SYBR Green染料购自Thermo Fisher公司。

多胺液相检测所需色谱级乙腈、甲醇购自美国Fisher公司；苯甲酰氯购自Aladdin试剂公司。

细菌培养液为ADF培养基。

1.3 实验方法

1.3.1 细菌培养

（1）挑取单菌落于10 mL液体培养基中培养12～16 h。（2）吸取等量菌液接种于不同pH值的培养基中培养12～16 h。

1.3.2 样品处理及液相检测

收集不同培养条件下阴沟肠杆菌上清液，冷冻干燥后用5 mL超纯水溶解，取2 mL溶解液加入20 μL苯甲酰氯衍生，衍生完毕后向溶液中加入1 g氯化钠、2 mL乙醚漩涡震荡，将乙醚层移至5 mL离心管中，用氮气吹干后以甲醇溶解抽滤，进行液相色谱检测。

1.3.3 定量PCR检测不同pH条件下ODC基因的表达

提取细菌RNA反转录，以SYBR Green I荧光定量法分析ODC基因的表达变化，退火温度为55℃，72℃收集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 液相法检测菌体上清液中腐胺含量

高效液相法检测不同培养条件下上清液中腐胺含量，结果如图1～2所示。在pH为5时上清液中无腐胺检出，随着pH值升高，阴沟肠杆菌上清液中腐胺含量升高，pH为8时约为0.25μg/μL，随后上清液中腐胺含量降低，实验3次重复，取平均值。图1A为腐胺标品液相检测，腐胺标品的保留时间为3.958，图1B为不同pH条件下菌体上清液中腐胺分析结果。

图1 阴沟肠杆菌腐胺液相检测图谱

图2 不同pH培养条件下阴沟肠杆菌产腐胺含量变化

2.2 不同pH条件下ODC基因表达定量分析

以SYBR Green法通过定量PCR分析ODC基因的表达变化，实验以16S rDNA为内参，以pH为7的样品结果为对照，（本研究主要是探讨在酸碱条件下多胺合成基因的表达变化，所以选择中性条件为对照）以其他实验组与对照组的比值为结果作图，结果如图3所示。在pH为8时，ODC基因表达量最高，结果与液相检测一致。

图3 不同pH条件下ODC基因表达调控变化

3 讨论

本研究对不同酸碱条件下阴沟肠杆菌产腐胺情况及腐胺合成关键基因ODC的表达变化进行了研究分析。在pH为6和9时，腐胺含量下降，荧光定量分析不同pH条件下ODC基因的表达调控发现，在pH为8的偏碱条件下该基因表达量最高，这与液相检测结果一致。多胺是细菌生长、分化及生殖的必需元素，在逆境条件下细菌通过多胺的表达调控度过不良环境[7-8]，本研究的结果表明阴沟肠杆菌在偏碱条件下ODC的表达升高，同时细菌上清液中腐胺含量最高，此结果说明腐胺合成变化可能是该菌适应碱性环境的主要原因，腐胺是精胺及亚精胺合成的主要底物，阴沟肠杆菌在偏碱条件下腐胺生成量升高，可进一步转化为亚精胺及精胺[10]，进而通过其他环节调控帮助细菌度过不良环境。