Runx2 和其它相关因子在黄韧带骨化的分子发病机制研究进展

曹兵 陈雄生

黄韧带骨化症 ( ossification of the ligamentum flavum，OLF ) 是由弹性纤维组织和结缔组织组成的黄韧带发生异位骨化引起脊髓压迫的一种疾病[1]。OLF 的好发部位大多集中在下胸椎[2]，以 T10～11和 T11～12最为多见。国内 OLF发病高达 3.8%，女性多见，同时约 1 / 3 的患者存在多节段发病[3]。在导致胸椎脊髓压迫的疾病中，OLF 是最常见的病因之一[3]。OLF 引起脊髓病的常见症状包括下肢功能障碍，可伴有疼痛、麻木、大小便障碍等括约肌功能障碍，甚至发展为截瘫，严重影响患者的生活质量，增加家庭和社会经济负担[4]。

OLF 发病的分子机制仍不明确，但大量文献报道 Runt相关转录因子 2 ( runt-related transcription factor 2，Runx2 )在这个过程中发挥关键的调控作用[5-7]。Runx2 是一种间充质细胞向成骨细胞分化的特异性转录调节因子，参与多条信号通路，所形成的复杂调控网络可能在 OLF 发生发展过程中起到了关键性作用[8]。为了进一步阐明 Runx2 在OLF 发病机制中的作用，笔者根据现有的研究结果，将Runx2 作为复杂调控的中心，分别阐述与 Runx2 相关的几条分子通路如何介导异位骨化过程的发生，进而为后续研究提供基本的参考依据并讨论未来可能的研究方向。

一、Runx2 的生物学功能

Runx 是一类高效转录因子。Runx 家族成员分为Runx1、Runx2、Runx3 三型，可影响人体生长发育及肿瘤发生等生理病理进程[8]。其中 Runx2 在骨代谢调节方面作用最为显著。Runx2 是与果蝇蛋白 Runt 同源的骨转录因子，Runx2 是一个主基因，其编码与间充质前体成骨分化过程有关的蛋白质[9]。Runx2 可诱导骨细胞外基质蛋白合成，促进间充质细胞向成骨细胞分化，以及促进软骨细胞形成和软骨内血管分化[7,10]，Runx2 对于成骨细胞分化和软骨细胞成熟至关重要[11]。

有研究发现，Runx2 基因可结合成骨细胞特异顺式作用元件，激活骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白和 I 型胶原基因的表达[7,10]。Runx2 促进细胞外基质形成，继而促进骨愈合；同时，细胞外基质蛋白又可通过激活 MEK / ERK信号转导通路，进一步上调成骨细胞内 Runx2 表达，实现 Runx2 与细胞外基质蛋白之间正反馈调节，加强 Runx2对成骨分化诱导作用[12]。Ueta 等[13]研究发现，外源性Runx2 能刺激肥大型软骨细胞表达血管内皮细胞生长因子，促进局部血管生成，加速软骨内成骨的过程。Runx2是骨骼发育必不可少的转录因子，Runx2 在软骨细胞的成熟中起主要作用，此外，其对于成骨细胞分化和增殖必不可少的[14]。Runx2 可调节间充质干细胞向成骨细胞的分化，并进一步成熟为成骨细胞[15]。

Runx2 对于成骨细胞分化和骨骼形态发生都具有至关重要的作用，目前作为骨形成标志被广泛运用于各类研究中。

二、Runx2 在 OLF 发病机制中的作用

研究发现，Wnt 信号通路、BMP 信号通路及 Notch 等信号通路均具有促进成骨基因表达的作用，在成骨细胞分化和增殖过程中被激活[16]。Runx2 作为这些通路的枢纽，可能在 OLF 发生的过程中发挥重要调控作用。

1. Wnt 信号通路：Wnt 是一类富含半胱氨酸的脂锚定糖蛋白，可连结脂蛋白受体相关蛋白 5 / 6 ( lipoprotein receptor related protein 5 / 6，LRP5 / 6 )，抑制胞内糖原合酶 β，诱导 β-连环蛋白的累积；β-连环蛋白转入核内并激活 T 细胞因子 / 淋巴增强因子 ( T-cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF / LEF ) 的转录[17]。TCF 调节单元是 Runx2 相关基因的启动子，可促进成骨相关基因的表达，调节细胞周期，改善骨形成微环境并影响软骨细胞和破骨细胞的功能[10]。Yayama 等[18]通过实验进一步证实 Wnt 信号通路可通过调节间充质干细胞分化为成骨细胞，启动软骨内骨化，并导致 OLF 的出现。通过向培养的成骨细胞中添加重组人 Wnt3α，诱导乙酰胆碱酯酶( acetylcholinesterase，ACHE ) 基因的表达，而通过 ACHE基因启动子中 Runx2 结合位点证实 Runx2 是 Wnt / β 连环蛋白信号通路的下游转录因子[19]；另一方面，Runx2 过表达可在体内或体外抑制 Wnt / β 连环蛋白水平和活性[20]；但关于 Runx2 过表达抑制 Wnt / β 连环蛋白与 Runx2 作为Wnt / β 连环蛋白下游转录因子两种相互作用如何平衡尚不明确。

锌指结构转录因子 ( Osterix ) 在成骨细胞中表达，是骨生成过程中必需的转录因子[21]。Osterix 通过促进相关成骨基因表达，促使成骨细胞的发育和成熟[22]。Runx2 基因位于 Osterix 上游，可启动 Osterix 的转录，进而激活 Wnt信号通路。Nakashima 等[22]发现 Runx2 基因敲除小鼠缺少 Osterix 的表达，从动物实验水平进一步验证转录因子Runx2 对 Osterix 的调控作用。在骨骼发育过程中 Wnt 信号通路可调节成纤维细胞生长因子 ( fibroblast growth factor，FGF ) 的活性，而 FGF 可促进 Osterix 基因的表达，同时对 Runx2 基因也具有较弱的诱导作用[23]。此外，转录因子 Osterix 还可通过上调 DKK1 ( Wnt 抑制剂 ) 水平实现对Runx2 / Wnt 信号通路的负反馈调节[24]。

以上研究说明，转录因子 Runx2 主要通过促进 Osterix的表达激活 Wnt 信号通路，启动黄韧带内的异位成骨过程，并最终导致骨化物的形成。

2. 骨形态发生蛋白 2 ( bone morphogenetic protein，BMP-2 ) 信号通路：BMPs 属于转化生长因子 β ( transforming growth factor beta，TGF-β ) 亚家族的一类细胞因子，可在骨转移过程中发挥诱导成骨作用，其中 BMP-2 通过聚集骨源细胞及诱导成骨分化发挥骨修复再生的作用[25]。Qu等[26]发现，由碱基突变导致的 BMP-2 基因表达上调可能是胸椎黄韧带发生骨化的可能机制。机械牵拉刺激是引起BMP-2 过度表达的诱因之一[27]。Shunzhi 等[28]研究证实机械牵拉刺激通过 BMP 信号通路促进黄韧带内异位成骨过程的启动。具体机制为：BMP-2 与 I 型或 II 型跨膜丝氨酸激酶受体蛋白形成异源四聚体复合物，促进胞内 Smad / 1 /5 / 8 磷酸化，联合 Smad4 后转移到细胞核内，刺激转录因子 Runx2 并上调成骨细胞基因的表达，最终促进黄韧带内成骨分化过程[29]。

BMP-2 信号通路的成骨作用同样是通过 Runx2 作为中间介导实现的。Javed 等[29]通过建立 Runx2 C 端链的突变，阻止 Runx2 与母亲 DPP 同源物 2 ( 果蝇 ) ( sekelsky mothers against dpp，Smad ) 连接，导致 BMP-2 / TGF-β无法整合，抑制了成骨分化早期阶段相关基因的表达。Gomis 等[30]发现，叉头框蛋白 ( forkhead box，FOXO ) 通过与 Smad 相互作用，调节 TGF-β 信号通路。此外，FOXO1具有刺激 Runx2 表达以及促进间充质细胞分化为成骨细胞的作用[31]。因此，Runx2 可通过上述机制调控 BMP-2 信号通路，从而影响骨化过程。

BMP-2 信号通路与 Ostriex 之间也存在相关关系[22,32-34]。因此，Runx2 也能通过与 Osterix 的相互作用，激活 BMP-2 信号通路，从而促进 OLF 过程的发生发展。Dlx5 是 BMP 诱导 Runx2 表达必不可少的介质[35]；BMP-2信号传导刺激 p300 介导的 Runx2 乙酰化[36]。Dlx5、p300在 BMP-2 介导 Runx2 信号通路中作用位点及是否存在相互影响尚未可知。

3. Notch 信号通路：Notch 信号通路是决定细胞命运和功能的重要信号通路之一，在骨骼发育和重塑过程中发挥关键作用。Notch 信号通路的激活可抑制成骨过程的启动。现有研究主要报道了以下几种可能机制：Notch 信号通路可间接抑制 Runx2 的表达，从而抑制成骨过程[37-38]。此外，Notch 信号通路还可对丝氨酸 / 苏氨酸激酶 ( Protein Kinase B，PKB / AKT ) 发挥双向调控的作用，进一步导致β-catenin 的降解或维持其稳定，从而抑制成骨分化[39-43]。Notch 通过受体 N1ICD 结合 BMP 信号通路下游分子Smad1，对 BMP-2 诱导 Msx2 分泌起到促进作用[44]。Notch靶基因 Hey1 通过废除 Runx2 的转录活性负性调节成骨细胞分化与成熟[45]；Notch 通过抑制 Runx2 转录活性负调节骨髓间充质基质细胞 ( bone marrow mesenchymal stromal cells，BMMSC ) 的成骨作用[38]。Notch 信号通路刺激BMP-2[44]，继之，BMP-2 对 Runx2 有诱导作用[29]，但目前尚未报道 Notch 信号通路通过 BMP-2 对 Runx2 产生间接诱导作用，其中原因仍需要进一步研究。

4. FGF 信号通路：FGF 信号通路可调节关键的细胞生理活动，包括细胞增殖、细胞分化和细胞存活[27]。在骨骼发育过程中 Wnt / β-catenin 可调节 FGF 的活性，而 FGF 可调控 Osterix 的表达，同时对 Runx2 也具有较弱的调控作用[23]。FGF2 可激活 Runx2 的表达，从而促进成骨[40-41]。FGF-2 通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 途径介导 Runx2的磷酸化和激活[41]；FGF2 通过诱导 Runx2 表达，支持细胞分化和骨骼发育[46]；Wnt / β-catenin 可调节 FGF 的活性，而 FGF 可调控 Osterix 的表达，结合 Osterix 可通过上调 DKK1 ( Wnt 抑制剂 ) 水平实现 Runx2 / Wnt 的负反馈调节[24]，上述反馈通路在 Wnt / β-catenin / FGF / Osterix /Runx2 信号通路中如何发挥作用却很少研究报道。

5. 瘦素 ( leptin ) 信号通路：Leptin 不仅在调节体重、能量代谢方面作用显著，而且在糖脂稳态维持、再生、免疫、炎症、骨骼发育和组织重塑方面也具有重大意义[42]。通过对比 OLF 女性患者与非 OLF 女性体内 leptin 受体mRNA 表达，发现 OLF 女性患者体内血清 leptin 水平明显升高[43]。Leptin 激活 STAT3 分子通路，结合 Runx2、类固醇受体共激活剂 1 形成转录复合物，作用于 Runx2 靶基因启动子，激活成骨基因，最终促进黄韧带异位成骨过程；Leptin 对黄韧带细胞的成骨诱导作用是通过 MAPK 信号通路实现的[47]。胸椎黄韧带骨化细胞和黄韧带非骨化细胞均存在 leptin 受体[47]，但 leptin 选择性作用于胸椎黄韧带骨化细胞的具体机制尚不清楚。

6. 其它信号通路：甲状旁腺激素信号通路可通过激活PKA，促进 Runx2 的转录，抑制骨吸收，从而间接促进成骨[48]。此外，Runx2 在分化的成骨细胞中过度表达也会反馈性抑制甲状旁腺激素 ( parathyroid hormone，PTH ) 在体内的合成代谢[48]。

综上所述，OLF 成骨诱导过程中，Runx2 参与 Wnt 信号通路、BMP 信号通路、Notch 信号通路、FGF 信号通路、Leptin 信号通路等，并作为上述信号通路作用枢纽在成骨诱导过程中发挥着重要作用。现有文献可证明各类细胞因子、转录因子可直接或间接通过 Runx2 调控 OLF 的发生发展。既往研究增加了对 OLF 发病机制的认识，但很多环节及现象仍然无法用已有的研究结果来解释，尤其是 OLF 分子机制中存在很多双向调节，这些问题仍需要进一步深入的研究。此外，如何将上述研究进展应用于临床工作中仍是亟待攻克的难题。