小鼠纹状体与视网膜的比较转录组学分析

须周恒，朱营利，孙孟菲，魏志远，潘佳琪，潘旭斌，陈建欢

1)江南大学无锡医学院，江苏无锡214122；2)江南大学附属医院(无锡市第四人民医院)，江苏无锡214062

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种严重的神经退行性疾病，病变表现为中脑黑质多巴胺能神经元退行性死亡，以引起纹状体多巴胺含量显著减少，继而导致肌张力异常.主要症状表现为以静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍为主的运动异常和以抑郁、便秘和睡眠障碍为主的非运动症状[1].纹状体由豆状核与尾状核组成，是基底神经节重要的组成部分.豆状核由苍白球与壳核组成.纹状体中尾状核、壳核、苍白球与丘脑底核、黑质在结构与功能上是紧密相联系的，其中苍白球是纤维联系的中心.基底神经节有重要的运动调节功能，它与随意运动的产生和稳定、肌紧张的调节和本体感受传入冲动信息的处理都有关系.纹状体因其重要功能在PD病理过程中扮演重要角色.

视网膜常被认为是相对独立于大脑的神经系统.但视网膜和视神经与大脑有着相同的胚胎起源，且有类似的血管形成、自我调节血流和血液-组织屏障功能的模式.作为中枢神经系统(central nervous system, CNS)的延伸，视网膜具有的血-眼屏障(blood-retinal barrier, BRB)，其在结构上类似于血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的组分和机制，具有特定的免疫豁免权.近年来，许多中枢神经系统疾病被发现常伴有视觉系统的受累[2-5].RAMIREZ[6]指出，视网膜病变可以是某些神经退行性疾病，如PD和阿尔兹海默症的一种临床表型，有可能作为早期诊断的一个检测指标.视觉幻觉(visual hallucination, VH)是PD的一个特定症状，且PD患者中多见视网膜多巴胺含量下降和中央凹视力功能障碍[7].而来自中心和外周途径的视觉信息处理缺陷被认为是PD中VH的病理生理学机制[8].但是，PD中视网膜受累的分子机制目前仍然不明确.

许多基因被证明与PD相关，其中，α-突触核蛋白(α-synuclein, SNCA)被认为参与多巴胺释放和转运的调节，诱导微管相关蛋白tau的纤维化，并通过抑制p53表达和促凋亡基因的反式激活导致非多巴胺能神经元发挥神经保护表型，导致caspase-3活化减少[23]，其突变常常引起PD 的发生.

比较转录组学，是研究比较不同生物学组织或样本之间的细胞/组织在转录组水平的异同点.转录组学被广泛应用于包括PD在内的神经系统疾病的研究中[9-13].但到目前为止，尚未见对视网膜与脑组织的基因表达谱差异进行比较，以及挖掘其与PD相关生物学意义的有关报道.本研究利用转录组测序和生物信息学分析的方法对正常小鼠视网膜及纹状体内表达差异的基因进行了分析，对PD与视网膜改变关系的重要分子基础进行探讨.

1 材料与方法

1.1 动物组织的采集

实验采用3只12周龄雄性C57/BL6小鼠，获得了江南大学动物伦理委员会的许可，采用吸入式麻醉剂异氟烷对小鼠进行麻醉后，通过心脏灌注法对小鼠处死(小鼠的处死及组织取材方法请扫描论文末页右下角二维码查看)，针对纹状体和左眼视网膜进行组织取材料，新鲜组织离体后迅速切成小块并置于Trizol溶液中，待组织块完全溶解后直接进行总核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)的提取.将3个视网膜样本分别编号为R1、R2和R3，3个纹状体样本分别编号为S1、S2和S3.

1.2 组织总RNA的提取

利用酚-氯仿法对所采集的小鼠的纹状体和视网膜组织进行总RNA的提取.

1.3 RNA测序

所提取的总RNA使用质量浓度为10 g/L的琼脂糖电泳进行降解与污染的检测，并用kaiaoK5500®分光光度计测纯度.RNA的完整性和浓度用RNA Nano 6000 assay试剂盒在Bioanalyzer 2100上进行测定.按试剂盒说明书，使用NEBNext®UltraTM Directional RNA library Prep kit以核糖体RNA减除法构建文库，并使用Qubit®RNA assay kit和 Qubit®2.0进行文库质检.所得文库在Illumina Hiseq 4000平台上使用150碱基对(base pair, bp)进行双端测序.每个样本的测序量均不低于12 Gbase.

1.4 读段比较及差异表达基因的分析

所得读段使用Fastqc进行质量评估.将评估合格读段比较到小鼠的全基因组序列(UCSC版本mm10)上.基因的表达分析使用FeatureCounts进行计数分析，用Bioconductor 的edgeR语言包进行差异表达基因 (differentially expressed gene, DEG)分析.为保证得到高度可信的DEG，差异倍数(flod change, FC)的对数值(lb FC)[2]大于2，较正后的假阳性发现率(false discovery rate, FDR)小于0.05的基因，认为是带分析的候选DEG.

1.5 差异表达基因的组成分析

利用R统计语言的Bioconducter软件包pheatmap 绘制DEG的热图.利用DEG数据和ggplot2软件包中的autoplot函数绘制主成分分析图.

1.6 差异表达基因的功能及通路富集分析

利用DAVID (版本6.8)生物信息学网站(http://david.ncifcrf.gov)对纹状体和视网膜组织的DEG进行功能富集(gene ontology, GO)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)信号通路富集分析[14-15].

1.7 基因网络图分析

利用cytoscape(版本3.7.1)中的STRING软件包(https://string-db.org)对相关的DEG进行基因间相互作用分析，并绘制网络图.

2 结果与分析

2.1 小鼠纹状体与视网膜转录组差异表达比较

对两组小鼠组织中的DEG分析.结果表明，有2 478个基因出现了表达差异(FDR<0.05，lb FC>2或lb FC<-2).其中，899个基因在纹状体中相对于视网膜呈现低表达，有1 579个基因在纹状体中相对于视网膜呈现高表达，由此构建纹状体-视网膜基因差异表达热图如图1(a).完整视网膜及纹状体间差异表达基因的表达差异热图和数据请扫描论文末页右下角二维码查看图S1和表S1.由图1和表S1可见，纹状体与视网膜的基因表达谱有着较大的差别，而主成分分析结果也可以看出在组内差异不大的情况下，两组样品可明显地聚为两类.由图1(b)可见，DEG主成分分析中的PC1对结果的解释度达到65.9%.

2.2 小鼠脑纹状体与视网膜差异表达基因的GO分析

利用DAVID数据库分析纹状体-视网膜差异表达的基因，分别对纹状体内显著高表达及低表达的基因进行GO分析，显示纹状体内高表达的基因参与的生物过程(biological process, BP)显著性最强的7个聚类(term)分别为：细胞通讯、信号通路、定位、突触信号、信号转导、跨突触信号传导和化学突触传递等.参与的细胞组成(cell component, CC)显著性最强的7个term分别为：细胞外周、膜、质膜、膜部分、神经元部分、质膜部分和膜的内在组成部分.参与的分子功能(molecular function, MF)分析显著性最强的7个term分别为：蛋白质结合、信号传感器活动、离子跨膜转运蛋白活性、跨膜转运蛋白活性、无机分子实体跨膜转运蛋白活性、分子功能调节剂和跨膜信号传导受体活性，见图2.完整纹状体高表达基因的GO分析结果请扫描论文末页右下角二维码见表S2.而视网膜内高表达基因的BP term显著性前7名分别为：核酸代谢过程、RNA代谢过程、调节RNA代谢过程、调节含核碱基的化合物代谢过程、调节基因表达、含核碱基的化合物代谢过程和RNA生物合成过程.显著性前7位的CC term则为：核、核质、核腔、核部分、核质部分、感光细胞纤毛和感光器外段.MF前7位的term分别为：DNA结合、核酸结合、转录调节活性、DNA结合转录因子活性、序列特异性DNA结合，以及双链DNA结合和调节区核酸结合，见图3.完整视网膜高表达基因的GO分析结果请扫描论文末页右下角二维码见表S3.纹状体内更倾向于膜表面信号转导相关基因的高表达，而在视网膜内，则是与其功能有关的视觉感受器相关基因表达更为活跃.

2.3 小鼠脑纹状体与视网膜差异表达基因的KEGG通路分析

将纹状体与视网膜差异表达的基因进行KEGG通路分析，结果显示，纹状体内高表达的基因主要富集在核糖体、阿尔茨海默病、氧化磷酸化、帕金森综合症、钙信号通路、亨廷顿病及神经活性配体-受体相互作用通路上，见图4.完整纹状体高表达KEGG分析结果请扫描论文末页右下角二维码见表S4.而视网膜高表达的基因基因富集通路主要有光转换、RNA降解、剪接、错配修复、基础转录因子、维生素消化吸收和细胞周期等，见图5.(完整视网膜内高表达基因KEGG分析结果请扫描论文末页右下角二维码见表S5).KEGG通路分析结果与观察到的GO分析的结果相互印证.

图1 小鼠脑纹状体与视网膜转录组水平的差异表达热图

图2 小鼠脑纹状体比对视网膜高表达差异基因的GO分析

图3 小鼠脑纹状体比对视网膜低表达差异基因的功能富集分析

2.4 PD通路相关基因在纹状体和视网膜中的表达

因小鼠脑纹状体高表达基因的KEGG数据分析显示了这些基因明显地在帕金森病通路上富集，利用STRING数据库的基因互作数据，对鼠纹状体在该通路中高表达的差异基因构建了基因互作网络，见图6.同时，针对所有PD通路基因在正常小鼠脑纹状体和视网膜两种组织中的表达情况进行比较.结果发现，共有129个PD通路基因被检测到有不同程度的表达，其中，有12个基因|lb FC|>2，11个在纹状体中高表达，包括：adenosine A2a receptor (Adora2a)、adenylate cyclase 5 (Adcy5)、dopamine receptor D2 (Drd2)、guanine nucleotide binding protein alpha inhibiting 1 (Gnai1)、guanine nucleotide binding protein subunit alpha L (Gnal)、leucine-rich repeat kinase 2 (Lrrk2)、septin 5 (Sept5)、synuclein alpha interacting protein (Sncaip)、synuclein alpha (Snca)、ubiquinol-cytochrome c reductase、complex III subunit XI (Uqcr11)和ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1(Uchl1).有意思的是，另一个差异基因cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 (Cox4i2)却是在视网膜高表达，见图7.尽管有该部分基因存在显著表达差异，两种组织表达的PD通路中的其余117个基因表达水平却比较接近，呈现较为相似的表达模式.

图4 小鼠脑纹状体比对视网膜高表达差异基因的KEGG通路分析

图5 小鼠脑纹状体比对视网膜低表达差异基因的KEGG通路分析

图6 利用STRING数据库构建的小鼠脑纹状体相比于视网膜高表达的帕金森病通路的基因互作网络

图7 在小鼠脑纹状体和视网膜中帕金森通路基因的差异表达比较

3 讨 论

帕金森病是一种复杂的多因素疾病，其致病原因包括基因突变、年龄老化、脑外伤和环境因素等[6]，但确切的致病机理仍不清楚.帕金森患者常伴有视网膜的受累，后者可呈早期临床表症，可能与多巴胺能神经元的死亡直接或间接地对视网膜产生影响有关.类似的大脑对视网膜的影响可能在多种疾病中存在，例如阿尔兹海默症患者的视网膜功能改变已经被报导，并被认为可应用于该病的早期检测[16].而根据KHOO等[17]的研究，PD患者独有的VH 改变存在于22%的PD病人中，因此视网膜的基因表达的改变有可能作为PD的早期生物标记物.本研究通过比较转录组学和生物信息学分析的方法，对正常小鼠的纹状体和视网膜的基因表达谱进行比较分析，发现了两者在基因表达、功能和通路上的异同.同时，也揭示了PD通路基因在两者中表达的情况，对PD与视网膜改变关系的重要分子基础提供参考.

视网膜是由脑的一部分延伸发育而来.作为视觉器官眼的核心组成部分，其功能上有相当程度的特化.本研究的转录组数据较好地验证了这一点，发现纹状体和视网膜的转录组水平表达有明显差异.其中，基因功能富集的结果显示，在纹状体中表现为信号转导及膜转运相关基因的高表达，这可能是纹状体作为中枢神经系统的主要神经结构之一的功能所决定.而在视网膜中表现为转录和视觉感受器相关基因的高表达，这可能与视网膜特殊的光感受与传导的功能有关联.这些基因中有部分，如Rhodopsin和RP1等，也是遗传性视网膜疾病的重要致病基因[18-19].这说明本研究方法能较好地将特异性表达的基因鉴定出来.在KEGG通路分析中，小鼠脑纹状体高表达的基因则富集到了一些神经疾病的通路，包括PD、阿尔茨海默病和亨廷顿病等重要的神经退行性疾病.而视网膜的基因则显示了剪接体等转录相关通路的富集，这可能与视网膜高度活跃的RNA加工和剪接有关[20-22].在遗传性视网膜疾病的已知致病基因中，有一部分已明确与剪接体有关.这也从侧面反映了所筛选的DEG有着较好的代表性.

PD疾病的信号转导通路是本研究的重点，我们对该通路在正常小鼠纹状体和视网膜的差异基因表达谱情况进行了较深入的生物信息学分析，试图探索PD疾病发病的分子基础.研究发现，虽然纹状体和视网膜的PD信号通路基因均有一定程度的表达，但在两种组织上有差异表达的129个已检测到的基因中，只有12个是在PD信号通路上，不到10%(即|lb FC|≥2)，而绝大多数(117个)PD通路基因是|lb FC|<2的，与纹状体呈现了相近的表达水平.这部分基因的显著改变，提示它们可能是PD患者视网膜病理性改变的关键分子基础.在|lb FC|≥2的基因中，包括了重要的SNCA 和它的相互作用蛋白(α-synuclein-interacting protein, Sncaip)，这从一定程度上解释了为什么纹状体可能对Snca的改变更加敏感.此外，电子传递链复合物Cox家族中的Cox4有两个亚基，Cox4i1及Cox4i2，后者是线粒体电子传递链的组成成分，也是PD通路的成分.而在小鼠视网膜中，仅Cox4i2基因的表达量高于在纹状体中的.另外，已知PD发病涉及毒素影响，因神经毒素在体内的活性形态MPP+是鱼藤酮等环境毒素的主要攻击目标，目前已成为PD动物造模研究的金标准，因此，本研究提出一个新的研究思路：MPTP这类毒性物质诱导的帕金森病模型可能用于PD视网膜的受累的分子机制研究.

结 语

本研究利用比较转录组学和生物信息学分析，对比分析了正常小鼠的纹状体与视网膜的基因表达谱，发现两者在基因表达、功能和相关信号转导通路上存在许多明显差异，证实了基因表达的差异在组织器官的功能特异性方面起到重要作用.同时，通过对与疾病相关的分析发现，PD信号转导通路上的多个基因在纹状体和视网膜也有着不同程度的表达，存在较高程度的相似性，可能是PD在纹状体与视网膜的共同分子发病基础，可为进一步研究PD与视网膜的病变关系提供参考.