二硝基苯胺类除草剂对单头切花菊‘白扇’的倍性诱导效果

杨惠婷　陈桂信　胡计红　吉玉婷　康建坂　潘腾飞　佘文琴

摘  要：以日本单头切花菊‘白扇无菌苗的带腋芽茎段为材料，选用2种二硝基苯胺类除草剂（二甲戊灵和氟乐灵）溶液在不同浓度和浸泡时间下进行诱导处理，并接种到生根培养基中诱导完整植株。通过早期突变形态、根尖细胞染色体计数、叶片气孔特征、农艺性状和开花的形态观察统计和对比，总结出除草剂对切花菊‘白扇无菌茎段的诱导效果。结果表明：200 μmol/L二甲戊灵和200 μmol/L氟乐灵分别浸泡36 h和24 h时诱导效果最佳，诱导率达25.00%和40.00%。经诱导的变异植株普遍染色体数增多，农艺性状变化明显。变异植株的叶片气孔和保卫细胞增大，气孔密度减小，株高和节间长度明显缩短，茎粗、叶长、叶宽显著增大，舌状花瓣形态出现多种明显变化且数量增多。

关键词：切花菊;化学诱导;二硝基苯胺;非整倍体;白扇

中图分类号：S682      文献标识码：A

Ploidy Induction Effect of Dinitroaniline Herbicides on the Single-headed Cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen

YANG Huiting1， CHEN Guixin1#， HU Jihong1， JI Yuting1， KANG Jianban2， PAN Tengfei1， SHE Wenqin1*

1. School of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Pingnan County United Front Work Department， Pingnan， Fujian 352301， China

Abstract： In this study， the stalk bud stems of Japanese single-headed cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen sterile seedlings were used as the materials， and two dinitroaniline herbicides （pendimethalin and trifluralin） were used at different concentrations and soaking time. Induction treatment was carried out and inoculated into rooting medium to induce whole plants. The ploidy inducing effect of herbicide on the sterile stem segment of cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen was summa-rized by statistical analysis and comparison of early mutant morphology， chromosome count of root tip cells， leaf stomatal characteristics， agronomic traits and flowering morphology. The results showed that the induction effect was the best when induced by 200 μmol/L pendimethalin and 200 μmol/L trifluralin for 36 h and 24 h， the induction rate was 25.00% and 40.00%. The number of chromosomes in the plants increased， and the agronomic traits changed significantly. The leaf guard cells and stomata of the mutant plants increased， the stomatal density decreased， the plant height and the internode length were significantly shortened， the stem diameter， leaf length and leaf width increased significantly， and the shape of the tongue petals showed various changes and the number increased.

Keywords： cutting Chrysanthemum; chemical mutagenesis; dinitroaniline; aneuploid; Iwa-no-hakusen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.007

菊花（Chrysanthemum morifolium）屬菊科菊属，多年生宿根花卉，原产自中国。菊花品种繁多，观赏性强，文化内涵深远，是深受人们喜爱的切花种类，在世界范围内广泛栽培。‘岩之白扇是夏季种植的单头切花菊品种，引种自日本，国内简称‘白扇。‘白扇花头洁白饱满，植株直立纤长，观赏性优良，抗逆性强，尤其耐热，是福建夏季栽培的单头切花菊典型代表。在花卉引种过程中，由于地理条件差异和自身生物特性，‘白扇不能完全适应新环境，出现抗逆性降低、品种退化的情况。‘白扇在福建省尤溪县的引种过程中就出现了因花茎细弱而导致出口运输时损耗过多和花头畸变的情况[1]。探究改良‘白扇选育新品种的方法和潜力具有十分重要的意义。

菊花多为高度杂合的异源多倍体，基因型复杂，染色体数量不固定统一[2]。菊花基因的复杂性是其巨大育种可塑性的基础，近年来国内外菊花的育种工作得到长足发展，引种驯化、杂交育种、诱变育种、分子育种在菊花上都有大量成功案例[3-6]。不仅花型花色有一定改变和创新，生长周期和抗病性方面也培育出很多改良品种。倍性育种的优势主要包括器官组织增大，品种抗逆性增强，次生代谢产物更多，并且倍性改变的植株在一定程度上能够克服远缘杂种不育性[7]。多倍体育种途径丰富，以秋水仙素诱导体细胞加倍最为常用，但嵌合体出现较多，对植物及人体的伤害明显。近年来一些实验证明[8-10]，一定浓度的二甲戊灵、氟乐灵、甲基胺草磷、戊炔草胺和安磺磷等二硝基苯胺类除草剂在诱导染色体加倍上同样具有很大的潜力。它们的诱导机理与秋水仙素相同，都是作用于植物微管蛋白，使有丝分裂中断，无法正常复制染色体从而实现染色体加倍。相比于常用的多倍体诱导剂秋水仙素，二硝基苯胺类除草剂对人体的毒害更小，效率更高，且更为经济实惠，在安祖花[10]、半枝莲[11]、金线莲[12]等植物中，均有良好的诱导效果。

因此，本研究选用二甲戊灵和氟乐灵2种毒性较低的二硝基苯胺类除草剂作为诱导剂，对切花菊‘白扇的无菌苗茎段采用浸渍法进行化学诱导。比较诱导后切花菊‘白扇染色体数量、叶片气孔的变化，以及移栽至大田后，株高、叶片大小、花序大小形态等农艺性状的改变，了解2种除草剂对诱导切花菊‘白扇的影响，通过采用倍性育种的方法在切花菊中进行尝试，直接或间接地为菊花的育种工作提供思路与技术参考。

1  材料与方法

1.1  材料

以福建省尤溪县三叶花卉农业合作社采集的切花菊‘白扇的带芽茎段为外植体，经离体诱导后接种于生根培养基（1/2 MS+0.03 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂粉，pH 5.8），选取同一批次长势优良且高度一致的无菌苗作为试验材料。

1.2  方法

1.2.1  多倍体的诱导  分别配制50、100、150、200 μmol/L的二甲戊灵和氟乐灵溶液，抽滤灭菌后作为诱导剂避光保存，并用等量无菌水作为对照。同一浓度诱导剂分成4瓶，用于4个不同处理时间。在无菌超净工作台上，将长势良好、高度一致的无菌苗切成1.5～2 cm的带不定芽点茎段，切去叶片保留叶柄，每瓶放入茎段20个，浸没于诱变剂中，避光，室溫条件下于150 r/min的摇床分别处理12、24、36、48 h。处理结束后用无菌水冲洗3次，滤纸吸干水分，接种于生根培养基（1/2 MS+0.03 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂粉，pH 5.8），每处理接种10瓶，每瓶接种茎段2个。重复3次。培养条件：温度（25±1） ℃，光照强度2500～3000 lx，光照时间12 h/d。

1.2.2  多倍体鉴定  在接入培养基的20 d进行观察筛选，将能萌发健康新叶的植株计为成活植株;以发生明显形态性状变化的植株计为变异植株。

染色体数目比较：采用常规压片法对染色体进行制片。选取初步鉴定出的变异植株和对照组的生根苗，于上午9：00 —10：00剪取1 cm长根尖，用饱和对二氯苯溶液在4 ℃条件下预处理4 h，蒸馏水漂洗2次后在常温下用卡诺氏液固定24 h，再用1 mol/L的HCl溶液在60 ℃下解离10 min，最后用卡宝品红溶液染色8～10 min，压片并将根尖植株敲散成云雾状。在显微镜下（100×）挑选染色体分散良好、染色体形态清晰以及染色体长度适中的中期分裂相，进行染色体数量统计。变异植株和对照组各统计20个根尖切片，每个切片选取3个细胞进行计数。

叶片气孔特征比较：选取生长阶段相近的变异植株和对照组植株各20株，撕取第5片新叶的叶片下表皮纸片，在光学显微镜下进行观察。每个叶片随机选择6个气孔，测量气孔的长度、宽度以及保卫细胞的长度、宽度，并计算平均值，对每个叶片随机选取3个视野拍照，统计每个视野（3488 μm×2621 μm）内的气孔数（对于不完整的气孔，明显大于1/2的气孔计为1个，其余气孔忽略不计）。

农艺性状比较：将生根苗炼苗移栽后，种于福建省尤溪县三叶花卉农业合作社的切花菊大棚进行统一栽培管理。于盛花期即栽种于大棚的第19周，剔除个别畸形苗和倒伏植株，对健康生长的变异植株和对照组全部单株的株高、茎粗、叶片大小、花序直径、舌状花数等农艺性状指标进行测量统计。

1.3  数据处理

用Excel 2010软件和IBM SPSS 21.0软件进行数据整理和统计分析。

成活率=成活株数/总株数×100%

变异率=形态变异株数/总株数×100%

2  结果与分析

2.1  2种诱导剂对切花菊‘白扇的诱导效果

根据对生长形态的观察，与对照组相比，部分经诱导的‘白扇明显植株粗壮，叶片明显变大，叶宽趋近于叶长，以此作为变异植株的初步统计标准，得到2种诱导剂对切花菊的诱导情况如表1。从表1可以看出，2种诱导剂处理后，在同种诱变剂处理下，同一时间范围内，随着诱变剂浓度的升高，成活率降低，变异率升高。在同一浓度的同种诱变剂处理下，也普遍呈现出处理时间越长，成活率降低，变异率升高的趋势。对照组全部成活且未产生变异植株。当二甲戊灵浓度为200 μmol/L，处理时间达到48 h;氟乐灵浓度为200 μmol/L，处理时间达到36 h时，变异率明显下降，甚至不产生变异。这是由于在高浓度长时间处理下，诱导剂对植物的毒害作用过强，一部分植株虽能成活，但是植株细弱矮小，无法健康生长。从表1还可以看出，对于浸泡法诱导切花菊，200 μmol/L二甲戊灵浸泡36 h时诱导效果最佳，成活率为43.33%，诱导率为25.00%;200 μmol/L氟乐灵浸泡24 h时诱导效果最佳，成活率为51.67%，诱导率为40.00%。分析结果表明，二甲戊灵和氟乐灵溶液以一定时间和浓度，对切花菊‘白扇无菌苗茎段采用浸泡法进行诱导，均能使其产生一定程度的变异。