荷花株型相关性状与SSR分子标记的关联分析

杨丹　杜凤凤　常雅军　崔键　孙林鹤　刘晓静　姚东瑞

摘  要：以129份株型多样性丰富的莲属（Nelumbo Adans.）群体为供试群体，观测与株型相关的立叶高度、花柄高度、立叶短径、立叶长径等数量性状。供试荷花群体株型性状变异丰富，立叶高度、花柄高度变异系数分别达39.68%和41.69%，立叶短径、立叶长径变异系数分别为29.70%和31.41%。选用多态性好的98对SSR引物对129份莲属种质进行多位点扫描。利用STRUCTURE V2.2软件对供试莲属品种进行基于混合模型的群体结构分析。利用GLM模型分析与莲株型性状相关联的SSR标记。结果表明：从群体结构看，供试群体最终可被划分为4个亚群，中国莲传统品种和中美杂交种属于不同的亚群，同时有部分遗传背景复杂的杂交种在不同亚群间分布。通过关联分析共找到11个标记与花柄高度、立叶高度、立叶长径、立叶短径等4个性状显著相关。其中，SSR067、SSR132、SSR458标记与所观测株型性状均显著相关，可能由于基因连锁或者一因多效引起。在连续2年的重复试验中，SSR132和SSR458标记均可与立叶长径、立叶短径相关联，表明这2个标记可能受环境影响较小。

关键词：荷花;株型;群体结构;关联分析

中图分类号：S813.3      文献标识码：A

Association Studies of Plant Architecture Traits and SSR Markers in Nelumbo Adans.

YANG Dan， DU Fengfeng， CHANG Yajun， CUI Jian， SUN Linhe， LIU Xiaojing*， YAO Dongrui*

Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014， China

Abstract： Totally 129 lotus accessions with different architecture were used as the experimental material. The leaf height， flower height and leaf diameter were determined. The accessed lotus population had diverse plant architecture traits. Variation coefficient for leaf height and flower height was 39.68% and 41.69% respectively， and variation coefficient for leaf length and width was 29.70% and 31.41% respectively. 129 lotus accessions were genotyped with 98 pair polymorphic SSR primers. Population structure of lotus accessions was analyzed using the STRUCTURE V2.2 software. Association analysis of lotus architecture traits was performed with the GLM model. The results indicated that lotus accessions were divided into four subgroups. The results distinctly grouped lotus accessions from Chinese lotus and Sino-American hybrids into different clusters. However， the hybrids dispersed among clusters. The results showed that 11 SSR markers were associated with leaf height， flower height， leaf length and width; three markers were associated with all the plant architecture traits， and that might be caused by multiple effects of one gene or genetic linkage. In two years of repeated tests， two markers （SSR132 and SSR458） can be associated with leaf length and width， indicating that these two markers may be less affected by environment.

Keywords： Nelumbo; plant architecture; population structure; association analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.002

荷花是蓮科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo）多年生水生植物，是被子植物中起源最早的物种之一，在中国已有2500多年的栽培历史[1]。荷花作为我国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值，同时兼具食用、药用价值，是我国最具特色、栽培面积最大的水生经济植物。莲品种繁多，目前已超过800余种[2]。

莲属目前仅存中国莲（Nelumbo nucifera）和美洲莲（Nelumbo lutea）。中国莲和美洲莲不存在生殖隔离，可以互相杂交[1]。美洲莲花色和花型单一，中国莲形态变异大，尤其在株型、花型、花色、花态等方面多样性非常丰富，且品种数量远多于美洲莲，是培育莲新品种、研究遗传多样性的重要资源。但由于荷花的很多观赏性状如株高、花朵大小等多表现为数量性状，是由多个基因和环境共同作用的结果，对其遗传基础的研究比较困难。

近年来，研究者采用RAPD、AFLP、ISSR等分子标记方法，在评估野生荷花种质或荷花不同地理群体的遗传多样性和亲缘关系方面做了相关工作[3-7]。由于上述研究的群体和对象存在较大差异，采用的分子标记技术也不同，使聚类情况较为复杂，部分研究并未检测出丰富的遗传多样性[4-5]，其研究结果有待进一步商榷。2013年，中国古代莲全基因组序列的公布，为莲功能基因组学、新基因挖掘提供了丰富的遗传信息[8]。Yang等[9]从我国古代莲的基因组序列中发现86 089个SSR motifs，测试开发了500对SSR引物，并利用这些新的引物构建了亚洲莲和美洲莲的遗传连锁图谱。这些报道在一定程度上有助于了解和掌握莲种质资源的遗传背景。杜凤凤等[10]采用SSR标记技术对42个荷花品种进行了聚类分析和群体结构分析，明确42个荷花品种的遗传多样性特征。杨郭阳[11]利用F1遗传群体构建了荷花遗传连锁图谱，采用复合区间作图法检测了株型相关QTLs位点。迄今为止，以荷花自然群体或种质资源作为材料，研究荷花株型相关性状的SSR关联分析未见报道。

本研究以129份株型多样性丰富的荷花群体为供试群体，利用多态性好的98对SSR引物，在分析遗传多样性和群体结构的基础上，进行SSR标记与立叶高度、花柄高度、立叶直径等株型相关性状的关联分析，旨在为荷花理想株型的构建及培育微型或大型荷花新品种提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料来源于江苏省中国科学院植物研究所荷花种质资源库，地理坐标为北纬32°04、东经118°45;年平均温度为15.7 ℃，年降雨量為1106.5 mm，年平均降雨天数为117 d。供试的129份中国莲种质名称见表1。所有品种于2017年、2018年清明左右翻池，采用种藕繁殖，连续2年7—8月盛花期观察记录。

1.2  方法

1.2.1  表型数据的选取与测量  每个品种随机选择3株有代表性、无病虫害、生长状态良好的植株进行观察测量，观察记录花柄高度、立叶高度、立叶直径等重要性状。各指标性状具有不同的记录标准，统计分析时对质量性状予以赋值，对数量性状进行分级分类。利用SPASS和Excel软件进行统计分析。

1.2.2  基因组DNA的提取和SSR分子标记  采集供试样品健康无病害的幼嫩叶片，利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒（Aidlab）提取各样品的基因组DNA;然后采用1%琼脂糖凝胶电泳和OneDrop分光光度计检测DNA质量和浓度;再将其浓度稀释至50 ng/μL，于?20 ℃保存备用。基于已报道[8-9]的荷花遗传连锁图谱和基因组信息，分别从遗传图谱的不同染色体上，选用多态性好且已开发的荷花SSR引物140对，随机选择5份供试荷花DNA进行扩增，筛选出多态性好、条带清晰的98对引物用于全部荷花品种基因组DNA样品的扩增。采用ABI 3730XL对扩增产物进行毛细管电泳检测，内参Liz 500（Ic?lo?ning）。采用GeneMarker软件对下机数据进行panel的编写及条带的判读。

1.2.3  SSR数据处理与软件分析  采用POPGENE 1.31软件计算位点数（Na）、有效位点数（Ne）、Shannon信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、Neis期望杂合度（He）[12]。利用PowerMarker V3.25软件基于Neis遗传距离构建UPGMA聚类图[13]。利用STRUCTURE v2.2软件分析基于混合模型的群体结构[14]。

采用TASSEL v2.1软件度量SSR位点间的连锁不平衡水平，计算其标准不平衡系数（D）和决定系数（r2），绘制LD配对检测的矩阵图[15-16]。在表型性状及群体结构和连锁不平衡水平分析的基础上，再次利用TASSEL v2.1软件[17]的GLM（General Linear Model）程序，以各个体的Q值作为协变量进行群体矫正，分别利用花柄高度、立叶高度、立叶直径（长径和短径）等性状数据对SSR分子标记变异进行回归分析，估算标记位点等位变异表型效应。

2  结果与分析

2.1  株型相关性状的统计分析

选择种质圃株型差异较大的129份荷花品种进行性状统计。与株型相关的数量性状分布情况及多样性统计结果见图1，立叶高度变异范围为7.5～141 cm，花柄高度变异范围为18.5～160 cm，变异系数分别达39.68%和41.69%。立叶短径、立叶长径变异系数分别为29.70%和31.41%。由此可知，供试荷花群体株型的性状变异丰富。

2.2  基于SSR扩增的遗传多样性分析

利用多态性好、条带清晰的98对SSR引物对129份莲属种质进行扩增，扩增产物经毛细管电泳荧光检测、测序获得等位基因数据，进一步分析其遗传多样性参数。98对引物共扩增得到537个位点（即总多态性位点数为537），每对引物扩增多态性位点2～16个，平均每对引物扩增位点数为5.48个。有效位点数（Ne）最大达7.77（引物SSR065），最小为1.16（引物SSR400），平均值为2.58。Shannon信息指数（I）最大为2.32（引物SSR065），平均值为1.04;观测杂合度（Ho）最大为1.00（引物SSR412、SSR240）;Neis期望杂合度（He）最大为0.87（引物SSR065）。引物SSR078的观测杂合度（Ho）和Neis期望杂合度（He）均较大，分别为0.99和0.83。引物SSR463的Ho和He也均较大，分别为0.99和0.83（表2）。

2.3  UPGMA聚类分析

根据SSR分析数据计算各品种间的Neis遗传距离，并进行UPGMA聚类分析，结果见图2。其中‘姬妃莲（119）、‘嵊县粉莲（117）、‘点额妆（126）、‘平头紫（121）、‘普者黑白荷（81）等传统品种最先被分类（图2中的蓝色部分），近年引入美洲莲基因后培育出的杂交莲品种‘六朝玉叶（80）、‘江南烟雨（78）、‘珠峰翠影（79）、‘秦淮翡翠（75）、‘洋贵人（76）、‘俊愉莲13B（33）、‘金陵女神（83）、‘金陵畅想（96）、‘江南碧菡（59）、‘琴韵（70）、‘大师（77）等聚在一起（图2中的红色部分）。聚类结果出现了很多不同的亚群，且未发现与传统形态学分类直接相关。分析其原因，一是莲属大多数品种是通过自然杂交和对实生苗连续多年的人工选育而来，其遗传背景复杂、亲本信息不明;二是在长期的历史演化和人为育种选择的过程中，中国莲群体演化出了多个亚群。

2.4  群体遗传结构分析

利用STRUCTURE V2.2软件对供试莲属品种进行基于混合模型的群体结构分析。设定推测亚群数K=1～10，5个重复，根据运行结果计算LnP（D）及ΔK值[18]，分别绘制LnP（D）和ΔK随K值变化的散点图。如图3所示，LnP（D）随K值的增大缓慢增大，并在K=10时有所降低，ΔK值在K=3时达到最大值。如图4所示，当K=3时，即推定供试群体具有3种遗传组分，设定阈值为0.60，供试群体被分成4个亚群，分别为P1、P2、P3及混合群M1。P1亚群共包括10个品种，其中包括‘大师‘伯里王子等杂交莲品种。P2亚群共67个品种。P3亚群共包括25个品种，其中包括‘平头紫‘姬妃莲‘解放红莲等传统品种。剩余27个品种被分为混合群M1。

2.5  莲属重要性状相关联的SSR标记

以供试的129份种质对应的Q值为协变量，利用GLM模型分析与莲表型性状相关联的SSR标记位点，结果显示共找到11个标记与花柄高度、立叶高度、立叶长径、立叶短径等4个性状显著相关（P<0.001），其中SSR067和SSR132分別与株型相关的4个性状均显著关联。有5个标记与花柄高度关联，其中表型变异贡献率最大的是SSR132（0.5818）;有7个标记与立叶高度关联，其中表型变异贡献率最大的是SSR065（0.7264）;有6个标记与立叶直径（长径和短径）同时关联，其中表型变异贡献率最大的是SSR132（0.6706和0.6424）。分析结果发现，同一标记可与多个性状相关联，如SSR067、SSR132、SSR458标记均与花柄高度、立叶高度、立叶长径、立叶短径等性状相关联，可能由于基因连锁或者一因多效引起的。在连续2年的重复试验中，SSR132和SSR458标记均可与立叶长径、立叶短径相关联，这2个位点受环境影响可能较小（表3）。

3  讨论

群体遗传结构的解析对于种质资源的利用非常重要。迄今为止，很多园艺植物的群体结构已有相关报道[19-21]。在本研究中，UPGMA聚类分析表明供试莲群体内部存在不同亚群，其遗传背景较为复杂，STRUCTURE软件群体结构分析进一步证实了这一结果。群体结构分析可较好的区分传统品种与亚美杂交莲品种。在最大的亚群P2中，其遗传组分较为复杂，可能由于地理分割或者历史演化在群体内部产生了多个亚群。此外，有27个品种被分为混合群M1，可能与长期杂交育种过程中的基因渐渗有关[10]。

荷花的株型、花期等性状易受环境影响，与气候和栽培条件均有较大关系，这些性状的复杂性容易影响不同年份的关联分析结果。Yang等[22]利用AFLP、SRAP和SSR标记挖掘荷花花朵观赏性状和花期相关联的位点，结果发现14个标记可以和连续两年的花瓣数相关联，而对于始花期和花期性状来讲，很多标记在两年的数据观测中，都仅有一年与目标性状显著关联，推测花期性状可能受环境影响较大。在本研究中，一共找到11个标记与荷花花柄高度、立叶高度、立叶长径、立叶短径等4个性状显著相关。有2个标记可以连续两年与立叶长径、立叶短径相关联，而花柄高度、立叶高度这2个性状均只有一年可以与标记显著关联。这一结果可能由于气候或环境因素造成不同年份关联分析结果的差异。虽然以上发现的株型相关联位点在一定程度上受环境因素的影响，但这些位点的挖掘为莲的株型改良提供了依据，在今后的研究中，可采用高密度遗传图谱对这些重要位点进一步验证。

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收稿日期  2019-11-11;修回日期  2020-03-23

基金項目  农业农村部景观设计重点实验室开放基金项目（No. KF201802）;江苏省农业科技自主创新资金项目[No. CX（16）1024]。

作者简介  杨  丹（1996—），女，硕士研究生，研究方向：植物资源学。*通信作者（Corresponding author）：刘晓静（LIU Xiaojing），E-mail：liuxiaojingcau@126.com;姚东瑞（YAO Dongrui），E-mail：shuishengzu@126.com。