人参糖肽研究进展

俞 萍张庆贺,2陈长宝赵明月战 宇杜连云

(1. 长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2. 长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

人参为五加科植物人参(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根茎。据《神农本草经》等古籍记载，人参自古就被作为食品与药物来服用[1]，2012年卫生部将其正式列入药食同源中药[2]。人参性甘、微苦，微温，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效，主要用于治疗体虚欲脱、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、气血亏虚、惊悸失眠、免疫力低下、糖尿病等症状[3-4]。其所含的化学成分主要有皂苷、多糖、多肽、蛋白质、糖肽、聚炔醇、挥发油、氨基酸、有机酸类等[5-7]，其中人参皂苷、多糖、多肽以及糖肽等为生物活性成分。近年来，肽类成分因其分子量小于蛋白质而具有较高的生物利用度，又因其多具有独特的生物活性备受关注[8]，被广泛应用于药品、食品、保健食品及化妆品等领域。

文章拟综述人参糖肽的制备方法、分离纯化技术、检测分析方法、临床应用及药理活性等内容，并展望其未来发展方向，旨在为人参糖肽的进一步研究提供依据。

1 简介

糖蛋白是由Montreuil于1973年提出，是除核酸外，由蛋白质分子与一种或多种含有碳水化合物基团的物质组成的复合物[9-10]。糖肽(glycopeptides)是指糖蛋白和蛋白聚糖中，糖与氨基酸或多肽链以共价键相连而形成的区域[11]，且糖肽在食品中常用于制作酒类，如张奎昌等[12-13]发明了一种银杏糖肽酒的生产方法和一种富含大蒜糖肽的大蒜保健酒及其加工方法。人参糖肽(ginseng glycopeptides，GGP)相对分子质量为200～50 000 Da，其糖部分主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰半乳糖胺组成；其肽部分主要由17种氨基酸组成，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等[14-15]；具有降血糖、降血脂、降胆固醇、增强学习记忆能力、保护神经细胞、抗炎镇痛等功能活性[14，16-17]。

2 提取与分离

2.1 提取

糖肽类成分的提取方法主要包括水提醇沉法、醇提水沉法以及透析法等。杨明等[18]采用分级沉淀法得到人参糖肽粗提物后，将其用蒸馏水溶解，于0～3 ℃冰箱中冷冻放置24 h，过滤，除去不溶物，滤液中加入粉末活性碳脱色，搅拌，静置，滤去杂质，浓缩干燥，即可得到白色或微黄色精制的人参糖肽。王颖等[19-20]先采用透析法得到制备低相对分子质量人参糖肽的工艺，而后通过响应面法筛选制备低分子质量人参糖肽的最佳透析工艺：超滤液透析前其配制质量浓度为0.6 g/mL，透析时间为301.8 min，透析外液用水量为3.92 L，此条件下总糖肽量为人参水提物的79.26%。罗浩铭等[21]通过醇提水沉与超滤法相结合，将超滤后的分离液浓缩并冻干，得到收率为原药材7%的人参非皂苷部分，再采用先煎煮后过D101大孔吸附树脂洗脱、超滤、透析法得到人参糖蛋白[22]，其收率为人参药材的0.45%。综上，水醇法是人参糖肽的主要提取方法，为得到小分子人参糖肽，常与透析法联合应用，该方法提取工艺简单、经济、安全，适用于工业化大生产，尤其适用于食品或保健食品的开发。但其提取效果并不理想，采用新方法、新手段以提高人参糖肽提取率的最佳提取工艺仍有待进一步研究。

2.2 分离

南敏伦等[23]使用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱分离人参糖肽，并依次用0.2，0.5，1.0 mol/L的NaCl水溶液洗脱，再用Sephadex G-150、G-100柱分离纯化，采用0.2 mol/L的NaCl水溶液洗脱可得到PGP-II，且PGP-II为主要的降血脂活性组分，其相对分子质量为6 000，其中糖部分由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖4种单糖构成，物质的量为n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)∶n(G1c)=0.46∶1.61∶1.00∶2.37。杨明等[18]使用Sephadex G-100凝胶层析、醋酸纤维薄膜电泳、Con-A-Sepharose 4B、亲和层析证明了PGP-II为均一糖肽而不是糖和肽的混合物；甲基化分析表明，其糖肽中单糖的连接方式主要是(1→4)Glc、(1→4)、(1→6)Gal，(1→4或5)Ara，Ara和Glc为主要末端，Glc的6位，Gal的4或6位，Gal的(1→4)应该为分枝点；氨基酸分析表明，PGP-II肽部分由天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Fhr)、谷氨酸(Ser)、甘氨酸(Glu)等16种氨基酸组成。人参糖肽类成分由于其结构中糖和氨基酸的个数与种类不同，导致其化合物的分子量有较大差别，因此其分离手段主要是根据化合物的分子量不同而采用凝胶柱层析法，该方法具有操作简便，分离效果较好，重复性高等特点。有关人参糖肽的分离纯化的研究较少，且其分离纯化方法的研究不够深入全面，还有待改善。

3 检测与分析

3.1 含量检测

人参糖肽含量检测主要是以其中性糖、酸性糖及蛋白质含量为指标。苯酚—硫酸法常被用来测定中性糖含量[24-25]，以葡萄糖为标准品；间羟基联苯法常被用来测定酸性糖含量[26-27]，以半乳糖醛酸为标准品；Lowry法常被用来测定蛋白含量[28-29]，多以牛血清蛋白为标准品。

3.2 分子量分布测定

人参糖肽分子量测定常采用高效液相色谱法，该方法操作简便，灵敏度高，重现性好，分离度高，对质量控制具有重要意义。王颖等[30]使用高效液相凝胶色谱分析系统，以葡聚糖Dextran T系列为标准品制作标准曲线，利用GPC软件计算人参糖肽PG-g分子量分布；其选用OHpakSB-802(8.0 mm×300 mm)凝胶分析柱，以0.7% Na2SO4为流动相，柱温35 ℃，流速0.5 mL/min，此时人参糖肽PG-g是分子量为1 305 Da和581 Da左右的两种糖肽的混合物。王颖等[31]采用高效液相色谱法(HPLC)，以L-色氨酸、蛋白酶抑制剂、VB12、细胞色素C和牛血清白蛋白为对照品制作标准曲线，以pH 7.0的磷酸盐缓冲液为流动相，柱温为室温，流速0.5 mL/min，进样量20 μL条件下，人参糖蛋白显示出多个峰，其分子量分布为1～40 kU，平均分子量为17 731 U。罗浩铭等[21]运用HPLC，以相对分子质量为1 000，3 000，5 000，12 000，25 000的葡聚糖与葡萄糖标准品制作标准曲线，选用Sepax SRT SEC-100(Φ7.8 mm×300 mm，5 μm)色谱柱，柱温35 ℃，以pH 7.0的磷酸盐缓冲液为流动相，流速0.5 mL/min，测得人参非皂苷分子量为200～50 000 Da。

4 结构鉴定

4.1 糖类型

罗浩铭等[22]通过HPLC法分析人参糖蛋白组成糖，将样品制备成PMP衍生物，以PMP衍生物的各单糖为对照品，选用Diamonsil-C18分析柱(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以流动相A为磷酸盐缓冲液(pH 6.8)与乙腈体积比85∶15、流动相B为磷酸盐缓冲液(pH 6.8)与乙腈体积比60∶40，流速0.9 mL/min，柱温40 ℃，检测波长250 nm，进样量10 μL，得到的人参糖蛋白组成糖主要含有甘露糖(Man)、半乳糖(GalA)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖或N-乙酰半乳糖(GlcNAc或GalNAc)。

4.2 糖结构

王颖等[30]通过将人参糖肽PG-g制备成甲基化衍生物，将甲基化产物加入氢化铝锂的四氢呋喃溶液中，80 ℃反应16 h，然后加入稀盐酸至无气泡产生，离心取上层，吹干后二次甲基化，经水解、还原和乙酰化并进行GC-MS分离鉴定，结果显示GlcA和GalA为PG-g的非还原末端，其中以GlcA为非还原末端的较多，以(1→3)-连接的GalA和(1→6)-连接的GlcA为主链，(1→3)-连接的GalA含量高于(1→6)-连接的GlcA，同时在部分GlcA的C3位与少量GalA的C6位存在分支点，而Ara以(1→2，4)-连接方式存在于主链与支链中。

4.3 氨基酸种类

王颖等[31]将20 mg人参糖蛋白加至6 mol/L HCl中，并充入氮气封口，于110 ℃烘箱内水解22 h，冷却，摇匀，过滤，双蒸水定容至50 mL，取1 mL冻干后加入0.02 mol/L HC1摇匀，14 000 r/min离心15 min，吸取0.8 mL 上清液过0.45 μm滤膜，选用9 Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm)色谱柱，柱温为室温，以乙腈—水(55∶45，体积比)∶KH2PO4缓冲液(pH 7.2)=30∶70(体积比)为流动相，通过紫外检测器检测，检测波长254 nm，流速1 mL/min，结果显示，其肽部分主要由甘氨酸、半胱氨酸与苏氨酸等17种氨基酸组成。

5 功能活性

5.1 降血糖

人参糖肽在临床使用中可明显降低2型糖尿(T2DM)患者的血糖，虽起效比较缓慢，但效果持久，即使停止服用后，血糖在一段时间内仍处于一个较低的水平[32]。人参糖肽注射液已作为国家级治疗糖尿病(DM)的中药二类新药[33]应用于临床，其对体外糖基化有明显抑制作用，可用于消渴病、慢性并发症的预防和治疗，且具有补气、生津和止渴的功效[34]，并能增加机体免疫力和修复胰岛的功能[35]。Wang等[36]阐明了人参糖肽的降血糖机制，人参糖肽为β-受体激动剂，通过第二信使cAMP将信息传输至线粒体和细胞质，线粒体CST、MDH、SDH和CCO活性增加，导致糖有氧氧化过程改进和血糖水平下降，降低的血糖由PP活性升高导致的加速肝糖元分解来补充。刘雪梅等[37]通过建立2型糖尿病大鼠模型，采用高脂饲料喂养4周后再腹腔注射STZ的研究方法，表明STZ糖尿病小鼠受人参糖肽的影响血糖明显下降，糖脂代谢得到改善，抑制胰岛素抵抗和多种并发症，人参糖肽结合耐力运动对STZ糖尿病大鼠的效果优于纯人参糖肽和耐力运动。陈文学等[17]建立了2型糖尿病气阴两虚模型，将过量的青皮和附子颗粒通过灌胃给予糖尿病大鼠，结果显示人参糖肽可使糖尿病气阴两虚大鼠血糖水平显著下降。赵丽艳等[38-39]通过免疫组化法证实了人参糖肽对STZ引起的大鼠体外胰岛β细胞损伤有防护作用。综上，目前对人参糖肽的降血糖机制与作用研究比较深入，其良好的降血糖作用为糖尿病的治疗提供了新思路和新方向。

5.2 降血脂作用

刘雪梅等[40]通过建立高脂血症大鼠模型的方法研究了人参糖肽的降血脂作用，结果表明，耐力运动组、纯注射人参糖肽组与人参糖肽结合耐力运动组大鼠的TG、TC、LDL-C、ApoB、MDA显著低于高脂模型对照组，而HDL-C、ApoA1、SOD水平显著偏高；与耐力运动组相比，纯注射人参糖肽组TC水平显著偏低，SOD水平显著偏高，而其他指标无明显变化，人参糖肽结合耐力运动组TG、TC、LDL-C、ApoB及MDA水平显著偏低，HDL-C、SOD和GSH水平显著偏高；与纯注射人参糖肽组相比，人参糖肽结合耐力运动组TG、LDL-C、ApoB及MDA水平显著偏低，SOD、GSH显著偏高，而其他指标无明显变化；纯注射人参糖肽和单纯耐力运动可降低大鼠血脂水平，具有良好调节机体脂质代谢紊乱的作用；人参糖肽结合耐力运动对高脂血症大鼠的降脂作用效果优于单纯给予人参糖肽与单纯耐力运动。上述结果表明，人参糖肽降血脂作用的研究不够深入全面，且其作用机制均未见报道，后续可在相关方面进行深入研究。

5.3 抗炎和镇痛作用

田建明等[41]采用角叉菜胶及甲醛诱发大鼠炎症疼痛模型的研究方法，发现人参糖肽具有抗炎和镇痛效果；当角叉菜胶致炎后6 h，15，30，60 mg/kg的人参糖肽具有明显降低大鼠足肿胀度、炎症足组织丙二醛的效果；30，60 mg/kg 的人参糖肽具有明显降低该模型大鼠血清IL-1，IL-2，IL-4，TNF-α，组胺的效果；人参糖肽对甲醛致痛Ⅰ相(1～5 min)疼痛评分值基本无影响；15，30，60 mg/kg 的人参糖肽对疼痛模型大鼠脑组织5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素、谷氨酸和γ-氨基丁酸等基本无影响，但其具有显著抑制Ⅱ相(31～35 min)疼痛评分值的效果。说明人参糖肽虽具抗炎和镇痛效果，但其具体作用机制依旧不详，还有待进一步研究。

5.4 神经细胞保护作用

胡婧婷等[14]通过Aβ25-35处理的PC12细胞凋亡模型的方法，研究人参糖肽对神经细胞的作用；当在PC12细胞中加入人参糖肽后，细胞存活率明显提高，凋亡率与S期细胞百分比显著降低；当人参糖肽浓度为1 g/L时，细胞存活率最高可达121.07%，最低为108.61%。说明人参糖肽可减慢凋亡速度，具有神经细胞保护作用，但其作用机制还有待考究。

5.5 其他作用

人参糖肽除了具有降血糖、降血脂、抗炎镇痛、保护神经细胞的功能活性外，还具有增强学习记忆能力[21]、抗凋亡[42]、改善胶原交联[43]等药理作用。Li等[43]通过观察人参糖肽对大鼠尾腱胶原交联体内外的影响情况，发现尾腱胶原在人参糖肽的影响下，其溶解性明显增加。

6 结束语

目前，人参糖肽的研究主要集中于提取、分离、含量测定和功能活性等方面，但其提取方法较为单一、提取率低，且有关其分离纯化的研究相对很少，尤其是工业化的提取和纯化；由于人参糖肽结构的复杂性，其高级结构的鉴定研究有待提高；生物活性方面，其毒理学及临床试验也需逐渐开展，以及人参糖肽的构效关系研究也需进一步开展。