基于Fiber1基因分型的安卡拉病毒感染病例实验室检测

岳筠2李凤龙

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；4.遵义市红花岗区海龙镇农业服务中心，贵州 遵义 563099)

鸡安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ群C种血清4型(FAdV-4)引起的以心包积液、肝脏肿大出血为主要特征的疾病，又称心包积液-肝炎综合症。该病最早于1987年发生在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地区，因此称为安卡拉病，并很快蔓延到整个巴基斯坦地区[1，2]。此后世界上很多国家(如印度、韩国、美国等)相继暴发此病，造成了严重的经济损失[3]。安卡拉病毒粒子无囊膜，其主要结构蛋白有Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2，而Fiber1和Fiber2为2种重要的结构蛋白，具有型和亚群特异抗原决定簇[4]；病毒粒子具有252壳粒，其中二十面体的顶角壳粒为12个五邻体(penton)；五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，这在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用；二十面体上还有240个非顶角壳粒，称为六邻体(hexon)，其携带的抗原决定簇是中和抗体的靶标[5]。FAdV-4与FAdV-8b、包涵体肝炎病毒均能引起相似的临床症状，特别是肝脏的病变，在临床诊断时极易混淆[6]。为了快速鉴别并及时制定有效的防控措施，对鸡安卡拉病进行实验室快速准确诊断十分重要。2012年该病在我国山东、河北的养殖鸡群中出现[7]。2015年以来，在山东、河南、广东等地区呈暴发性流行，给家禽养殖业造成严重的经济损失[8]。2016年底，贵州省多地也发现疑似病例。本研究对贵州省某养鸡场发生的疑似安卡拉病毒感染病例进行实验室诊断和禽腺病毒基因分型鉴定，以确定病原种类和血清型，为贵州省安卡拉病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集贵州省某规模化养鸡场病鸡肝脏作为检测分析病料。

1.2 试剂DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR扩增试剂、限制性内切酶EcoRI和Xhol、DL 2 000 Marker、pMD19-T载体等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank公布的安卡拉病毒基因序列信息，设计合成Fiber1特异性引物核苷酸序列，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。序列信息见表1。

表1 引物信息

1.4 FAdV-4 PCR 检测应用DNA提取试剂盒对临床病例的肝脏组织样本进行总DNA提取，建立PCR反应体系25.0 μL：2-TaqPCR mastermix 12.5 μL，引物Fiber1R和Fiber1F各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR产物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪上观察结果。

1.5 目的基因测序及序列分析安卡拉病毒Fiber1基因PCR产物经电泳、胶回收纯化后，进行目的基因测序，与参考毒株进行序列分析，确定病毒流行株基因分型。参考序列见表2。

表2 FAdV-4参考毒株信息

2 结果

2.1 PCR检测结果应用基于安卡拉病毒Fiber1基因特异性引物对临床病料组织样本总DNA进行目的基因PCR扩增，结果见图1。病例肝脏组织样本总DNA中扩增出大小约1 296 bp特异性条带，与预期扩增片段大小相符。

图1 PCR检测结果M：DL 2 000 Marker；1：阳性对照；2～3：检测样本；4：阴性对照

2.2 PCR产物测序结果将PCR产物经电泳纯化后进行基因测序，测序序列见图2。PCR扩增目的基因大小确定为1 296 bp，与预期扩增Fiber1基因片段大小完全相符，毒株暂命名为：GZ-LPS。

图2 目的基因测序结果

2.3 目的基因核苷酸序列同源性分析结果应用DNAStar软件将Fiber1基因核苷酸序列与GenBank中参考毒株进行序列对比发现，本试验检测毒株与河北、江苏、河南等国内禽腺病毒Ⅰ群血清4型(FAdV-4)分离株同源性达99.8%以上，与国内FAdV-11分离株HBQ11同源性仅为23.2%。与国外的禽腺病毒血清4型分离株比较显示：与巴基斯坦分离株K31的同源性高达99.9%；与墨西哥分离株MX-SHP95、加拿大分离株ON1同源性达95.0%以上；与国内外FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11的禽腺病毒核苷酸同源性为23.2%～28.9%。见图3。

图3 目的基因核苷酸序列同源性比较

2.4 基因序列系统进化树分析结果应用MegAlign软件对FAdV-4贵州流行株GZ-LPS的Fiber1基因序列与国内外参考毒株Fiber1基因序列进行系统进化树分析。结果显示：本病例中的安卡拉病毒流行株GZ-LPS与国内河北、江苏等地FAdV-4分离株以及国外的FAdV-4分离株K31、MX-SHP9、ON1处于同一进化分支，而与国内外的FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11处于不同进化分支。见图4。

图4 目的基因序列系统进化分析

3 讨论

鸡安卡拉病的诊断目前以病毒的分离培养与鉴定、血清学鉴定和基于特异性基因的分子生物学鉴定为主，其中病毒分离鉴定多用于病毒学研究，但存在周期长、效率低等问题，而血清学鉴定对腺病毒众多血清型进行区分也存在特异性不高的问题，因此基于特定基因的分子生物学鉴定方法被广泛应用[9，10]。禽腺病毒根据抗原性的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，Ⅰ群禽腺病毒又分为A、B、C、D、E 5个种和12个血清型(FAdV-1-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9-11)，可见禽腺病毒种类繁多，依赖于传统的血清学分型技术需要大量的特异性抗体，成本高、效率低，而依赖于基因测序与序列分析的基因分型技术在禽病毒分类中已被广泛应用[11～13]。贵州省对本病的报道资料较少，为实现病例的快速诊断与及时处置，本研究开展了基于安卡拉病毒Fiber1基因分型的分子生物学鉴定，为实现安卡拉病毒的快速诊断及早发现、早治疗提供基础参考依据。

4 结论

通过对贵州某养鸡场病例进行实验室诊断和禽腺病毒基因分型鉴定，确诊为安卡拉病毒感染，分离毒株命名为“贵州株GZ-LPS”，与国内外FAdV-4参考株基因同源性高达99.0%以上，而与其他血清型基因同源性均较低。进化树分析显示该毒株与FAdV-4参考株亲缘关系最近，确定为禽腺病毒Ⅰ群 C种血清4型毒株。