SOX-9通过调控ADAMTS保护椎间盘

徐敏铭，温子欢，官 伟，王绪君，黄常盛

1.上饶惠阳医院骨科，上饶 334000

2.上饶市立医院骨科，上饶 334000

3.上饶清水医院骨科，上饶 334000

椎间盘位于椎体之间，司职脊柱旋转、屈曲和背伸活动的密闭性结构，包括中央髓核、外围纤维环以及上下两端软骨终板［1-2］。髓核位于椎间盘核心位置，在椎间盘发挥功能时起着至关重要的作用。椎间盘发生退行性变时，髓核变化最为明显，表现为以细胞外基质代谢紊乱为主的多种病理生理反应［3］。含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）是一种Zn2+依赖的基质降解酶［4］。研究表明，ADAMTS家族成员中的ADAMTS-4和ADAMTS-5可大量降解细胞外基质成分中的蛋白聚糖（ACAN），在退行性疾病中发挥重要作用［5］。SOX-9是软骨分化和早期睾丸发育过程中的关键调节因子，可调节ACAN和胶原纤维等细胞外基质成分的表达［6］。研究表明，SOX-9单倍体功能不全可引起严重的软骨发育不良、长骨弯曲等骨骼畸形，表明SOX-9对软骨细胞具有重要的调控作用［7］。然而，关于SOX-9在椎间盘中的表达情况以及SOX-9与ADAMTS-4、ADAMTS-5相互作用对椎间盘退行性变的影响，目前研究较少。因此，本研究拟探讨SOX-9和ADAMTS-4、ADAMTS-5在椎间盘退行性变中的作用及其相互之间的调控关系。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

ADAMTS-5抗体（a6727）购自Sigma-Aldrich公司；ADAMTS-4抗体（sc-25582）、Ⅱ型胶原（COL2A1）抗体（sc-28887）、ACAN抗体（sc-25674）、β-actin抗体（sc-47778）和SOX-9抗体（sc-20095）购自Santa Cruz Biotechnology公司；软骨寡聚物基质蛋白（COMP）抗体（ab128893）购自Abcam公司；反转录试剂盒（RR047A）、SYBR Green premix（RR420A）购自TaKaRa公司。GeneAmp 9700型荧光定量PCR仪为Applied Biosystems公司产品。

1.2 临床标本采集和处理

组织标本来源于40例因椎间盘退行性变或外伤后需行椎间盘摘除术的患者，标本收集均获得患者知情同意。对收集的标本采用Pfirrmann分级［8］系统进行退行性变等级界定，将一部分标本用10%中性福尔马林固定，通过HE染色、Masson染色和番红O-固绿染色鉴定椎间盘组织退行性变程度，其中Ⅱ级7例，Ⅲ级13例，Ⅳ级15例，Ⅴ级5例；一部分标本采用免疫组织化学染色观察ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达；一部分标本组织用于分离髓核细胞；其余组织用于提取总蛋白及RNA。

1.3 人髓核细胞分离和培养

根据Risbud等［9］报道的髓核细胞提取方法从髓核组织中分离人髓核细胞。人髓核细胞采用含10%胎牛血清并添加抗生素的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养，72 h后观察细胞贴壁情况并进行换液，以后每3 d换液1次，待细胞生长至约80%汇合时进行传代或冻存，取2 ～ 6代的细胞进行实验。

1.4 小干扰RNA（siRNA）转染和腺病毒感染

siSOX-9、siADAMTS-4、siADAMTS-5和FAM-siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司，转染前1 d将髓核细胞均匀铺于6孔板中，将siRNA和Lipofectamine 3000混合液加入细胞中，转染后24 ～ 48 h收集细胞进行后续实验。SOX-9过表达腺病毒购自上海汉恒生物科技有限公司，摸索最佳感染复数后直接加入细胞中，完成腺病毒感染。

1.5 蛋白质印迹分析

组织蛋白提取：组织标本离体后立即冻存于液氮，然后使用机械研磨将组织磨成粉末，加入含有蛋白酶抑制剂混合液的RIPA裂解液冰上裂解；细胞蛋白提取：髓核细胞从培养箱取出立即放在冰上冷却，用预冷PBS洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂混合液的RIPA裂解液，用细胞刮收集细胞及细胞裂解液。收集的裂解液于4℃条件下12 000 r/min（离心半径8 cm）离心15 min取上清，采用BCA法测定蛋白浓度；加入蛋白上样缓冲液，95℃加热5 min，然后进行电泳、转膜、封闭，加入相应的一抗、二抗进行孵育，显色后观察，计算目的蛋白相对表达量。

1.6 实时荧光定量PCR

采用RNeasy mini spin columns（Qiagen公司）提取总RNA，测定浓度后取2 μg反转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应体系：cDNA模板、目的基因特异性正向和反向PCR引物、灭菌水和SYBR Green premix（TaKaRa公司）。反应条件 ：95℃ 30 s；95℃5 s、60℃ 10 s、72℃ 25 s，40个循环。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以表示，组间比较采用Student’st检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 椎间盘组织病理学观察

根据Priffmann分级系统，将Ⅱ级退行性变组织设为对照，通过HE染色、Masson染色和番红O-固绿染色观察椎间盘组织退行性变程度，结果显示，正常组织（Ⅱ级）内髓核细胞数量较多，为大小较为均一的类圆形软骨样细胞，胶原纤维排列规整，层次清晰，细胞外基质ACAN含量丰富；而发生退行性变组织（Ⅳ级）内细胞数目少，散在稀疏，胶原纤维排列紊乱，各层之间出现断裂、崩解，ACAN含量明显减少，符合椎间盘退行性变的组织学变化（图1）。

图1 椎间盘组织病理染色Fig. 1 Histopathological staining of intervertebral disc tissues

2.2 椎间盘组织中ADAMTS的表达

免疫组织化学染色结果显示，ADAMTS-4、ADAMTS-5主要位于胞质中（图2a），发生退行性变的组织中二者的表达水平均高于Ⅱ级组织，且差异有统计学意义（P＜ 0.05，图2b）。实时荧光定量PCR（图2c）和蛋白质印迹分析（图2d）结果显示，发生退行性变的组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表达在mRNA和蛋白水平均上调，与Ⅱ级组织相比差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

图2 椎间盘组织中ADAMTS的表达Fig. 2 Expression of ADAMTS in intervertebral disc tissues

2.3 椎间盘组织中SOX-9和细胞外基质成分的表达

通过免疫组织化学染色及半定量分析（图3a，b）、实时荧光定量PCR（图3c）和蛋白质印迹分析（图3d）检测椎间盘组织中SOX-9和细胞外基质成分（COL2A1、ACAN和COMP）的表达，结果显示，发生退行性变的组织中SOX-9、COL2A1、ACAN和COMP的mRNA及蛋白表达均低于Ⅱ级组织，且差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

图3 椎间盘组织中SOX-9和细胞外基质成分的表达Fig. 3 Expression of SOX-9 and extracellular matrix component in intervertebral disc tissues

2.4 SOX-9对人髓核细胞ADAMTSs、COL2A1、ACAN和COMP表达的影响

提取正常椎间盘组织中髓核细胞进行原代培养（对照组），利用siRNA干扰或腺病毒过表达载体调节髓核细胞内SOX-9表达，通过siRNA阴性携带FAM［SOX-9（-）］及腺病毒携带GFP荧光［SOX-9（+）］表达可见转染效率达80%（图4a），同时蛋白质印迹分析证实干扰和过表达效率可靠（图4b）。蛋白质印迹分析（图4b）和实时荧光定量PCR（图4c）结果显示，干扰SOX-9表达后，细胞外基质成分COL2A1、ACAN和COMP表达下调，同时基质降解酶ADAMTS-4、ADAMTS-5表达上调；而SOX-9过表达可抑制基质降解酶ADAMTS-4、ADAMTS-5表达，并促使细胞外基质成分COL2A1、ACAN和COMP表达上调。上述结果提示，SOX-9在髓核细胞中可促进细胞外基质成分合成，并抑制降解反应。

图4 SOX-9对人髓核细胞ADAMTS、COL2A1、ACAN和COMP表达的影响Fig. 4 Effect of SOX-9 on expression of ADAMTS，COL2A1，ACAN and COMP

2.5 SOX-9通过ADAMTS调节细胞外基质成分的表达

蛋白质印迹分析（图5a）和实时荧光定量PCR检测（图5e）结果显示，抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5表达后，COL2A1、ACAN和COMP表达均上调，表明COL2A1、ACAN和COMP的表达受到ADAMTS-4、ADAMTS-5调控。蛋白质印迹分析（图5b，c）结果显示单一抑制SOX-9活性可下调COL2A1、ACAN和COMP表达，而同时抑制SOX-9和ADAMTS-4/ADAMTS-5后，COL2A1、ACAN及COMP表达相较于单一抑制SOX-9后上升，表明SOX-9通过ADAMTS-4、ADAMTS-5影响细胞外基质成分的表达。双荧光素酶报告基因检测（图5d）结果显示，SOX-9可下调ADAMTS-4、ADAMTS-5启动子活性，表明SOX-9可直接调控ADAMTS-4、ADAMTS-5表达。

图5 SOX-9通过ADAMTS影响细胞外基质成分的表达Fig. 5 SOX-9 affects expression of extracellular matrix components through ADAMTS

3 讨 论

有研究表明，ADAMTS家族中的ADAMTS-4和ADAMTS-5可通过酶切位点Glu373、Glu1545、Glu1714、Glu1819和Glu1919等降解ACAN，引发细胞外基质合成与分解代谢失衡，在骨关节炎中发挥重要作用［5，10］。Tian等［11］证实上述2种酶在椎间盘退行性变中的作用主要表现为促进细胞外基质，如ACAN、COMP、COL2A1等的降解。本研究结果显示，抑制髓核细胞内ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达可引起ACAN、COMP、COL2A1在蛋白及mRNA水平的整体上调，提示ADAMTS-4和ADAMTS-5不仅在蛋白水平发挥降解作用，同时在mRNA水平抑制转录活性，表明ADAMTS-4和ADAMTS-5促进ACAN、COMP、COL2A1降解的同时抑制合成，在细胞外基质成分的代谢中发挥双重作用，协同促进椎间盘退行性变的发生。

转录因子SOX-9已被证实在软骨细胞中发挥多重作用，其表达失调与骨关节炎息息相关［12］。鉴于关节炎与椎间盘退行性变发生机制类似，且髓核细胞与软骨细胞具有一定同源性，本研究组推测SOX-9在椎间盘中具有同等地位。有研究报道，SOX-9可促进ACAN、COMP、COL2A1等细胞外基质成分表达，而ADAMTS显著抑制ACAN、COMP、COL2A1表达［13-14］，与本研究结果一致，表明SOX-9和ADAMTS在调节细胞外基质表达层面存在一定竞争关系。关于SOX-9和ADAMTS之间是否存在调控关系目前尚未有统一观点，Kadaja等［15］通过染色质免疫沉淀测序（CHIP-seq）发现转录因子SOX-9可结合ADAMTS家族成员，而后通过转录组测序（RNA-seq）证实ADAMTS在SOX-9基因敲除小鼠中表达明显上调，表明ADAMTS表达受到SOX-9调控，但具体机制仍不明确。本研究直接在细胞层面通过基因过表达和干扰技术探索SOX-9对ADAMTS的调控作用关系，结果发现抑制SOX-9表达促使ADAMTS表达上调，而过表达SOX-9后ADAMTS表达明显下调。结合Kadaja等［15］的研究结果，推测转录因子SOX-9可能通过结合ADAMTS启动子位点进而影响启动子活性的方式调节ADAMTS转录水平。为此，本研究开展双荧光素酶报告基因检测试验，证实SOX-9确实被募集到ADAMTS启动子位点，降低了启动子活性，表明SOX-9可通过直接作用方式抑制ADAMTS的表达。

综上所述，本研究发现，发生退行性变的椎间盘组织中ADAMTS对细胞外基质成分的表达调控具有双重作用，表现为促进降解并抑制合成。SOX-9在椎间盘内通过直接作用的方式影响ADAMTS表达，进而调节细胞外基质成分的表达，最终发挥保护椎间盘的作用。关于椎间盘发生退行性变时SOX-9表达减少及功能紊乱的机制仍需进一步研究。