马丽霞,吴倩倩,董浩,刘阳,朱爱臣,王宪朋,李俊起,王传栋,王勤
(山东省药学科学院 山东省医用高分子材料重点实验室,济南 250101)
乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)是一种生物可降解合成高分子聚合物,具有良好的生物相容性及可降解性[1-5],在体内可降解成乳酸和羟基乙酸,参与人体的新陈代谢,最终形成二氧化碳和水被排出体外。其降解周期通过调节乙交酯和丙交酯的比例,可从几周到几年不等[6],被美国FDA批准应用于临床医学领域,并有多种产品上市,如强生的多股缝合线Vicryl®、Vicryl Rapid®、PANACRYL®,法国益普生的曲普瑞林PLGA微球,重庆永通的PLGA术后可吸收防粘连膜等。目前,PLGA在药物缓控释[7-9]、组织工程支架[10-14]、可吸收缝线[15-18]、防粘连膜[19-20]、骨植入物[21-23]以及超声造影剂[24-26]等方面的应用被广泛研究,在生物医学领域的应用潜力巨大。
PLGA作为生物医学材料安全性至关重要。我们以丙交酯和乙交酯为单体,通过本体开环聚合反应合成了PLGA,其中单体纯化、聚合物精制过程中分别使用了乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、乙醇等溶剂,为确保其残留量在安全使用限度内,建立PLGA残留溶剂的测定方法十分必要。目前,溶剂残留测定方法多见于药物,对高分子材料研究甚少。为此,本研究采用毛细管色谱柱,以顶空进样方式,对PLGA75/25和PLGA50/50(丙交酯与乙交酯摩尔比分别为75∶25和50∶50)的溶剂残留进行了测定,并建立了相应的测定方法。
Agilent 6890N气相色谱仪(FID检测器);Agilent 7697A型自动顶空进样器。
乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷均为色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司;丙酮,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司。PLGA 50/50(丙交酯与乙交酯摩尔比50:50),自制,批号:17061401、17091302;PLGA 75/25(丙交酯与乙交酯摩尔比75:25),自制,批号:17102401。
DB-624毛细管柱(30 m×530 μm×3.0 μm),柱温:初始温度100℃,保持5 min,然后以30℃/min的升温速度升至180℃;进样口温度:200℃;检测器温度:250℃;载气:N2,流速3.0 mL/min;分流比为10:1;顶空加热器温度:100℃;定量阀温度:110℃;传输线温度:120℃;顶空瓶平衡时间:20 min;进样体积:1 mL。
取乙醇、丙酮、乙酸乙酯各1.0 g,精密称定,置同一100 mL量瓶中;另取二氯甲烷1.2 g,精密称定,加二甲基亚砜溶解并定容至100 mL,精密量取10 mL,置上述量瓶中,用二甲基亚砜稀释并定容,作为标准贮备液。
精密量取标准贮备液5 mL,置50 mL容量瓶中,二甲基亚砜稀释并定容,作为标准溶液。
取乙交酯丙交酯共聚物1.0 g,精密称定,置于顶空瓶中,加入二甲基亚砜5 mL密封,待完全溶解,作为样品溶液。
乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯均具有一定的极性,根据“相似相容”原理,选用安捷伦DB-624毛细管柱进行测定。安捷伦DB-624毛细管柱其固定相等同于USP固定相G43,极性中等。
考察了顶空平衡时间10、20、30 min对残留溶剂测定的影响,研究发现,20 min各组分气液两相达到平衡,见图1。因此,结合顶空瓶的气密性,最终选择顶空温度100℃,平衡时间20 min。
图1 峰面积随平衡时间变化曲线
Fig.1The curve of peak area with the equilibration time
取标准溶液5 mL置于顶空瓶中,密封,顶空条件下平衡进样,记录色谱图,结果见图2。由图可见,出峰顺序依次为乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯,各成分峰间的分离度均大于1.5,四种溶剂分离良好。
图2 各溶剂气相色谱图
取标准溶液5 mL置于顶空瓶中,密封,顶空条件下平衡进样,连续进样6次,记算各对照峰面积的相对标准偏差RSD。结果表明,乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分别为1.65%、0.91%、1.81%和1.08%,精密度良好。
分别精密量取标准贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL,置于10 mL量瓶中,加二甲基亚砜稀释并定容,制备一系列线性试验溶液。分别取5 mL置于顶空瓶中密封,顶空条件下平衡进样,以峰面积(A)为纵坐标,浓度(c,mg/mL)为横坐标,建立线性回归方程,见表1。结果表明,乙醇、丙酮和乙酸乙酯均在0.2~1.5 mg/mL,二氯甲烷在0.024~0.18 mg/mL浓度范围内与各自峰面积线性关系良好。
表1 各溶剂线性方程和相关系数
取乙醇适量,精密称定,置于10 mL量瓶中,加二甲基亚砜溶解定容,摇匀,然后逐级稀释,精密量取稀释后的溶液5 mL,置顶空瓶中,密封,按照2.2节的色谱条件进样测试,满足S/N≥3作为乙醇的检测限,满足S/N≥10作为乙醇的定量限。同法测定丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的检测限和定量限。结果见表2。
表2 各溶剂的检测限和定量限结果
采用加样回收方法,精密量取标准贮备液4、5、6 mL,分别置于50 mL量瓶中,用二甲基亚砜稀释定容,摇匀,作为80%、100%和120%回收率对照溶液。取样品约1.0 g,精密称定,置顶空瓶中,精密加入80%回收率对照溶液5 mL,密封,待样品全部溶解,作为80%回收率样品溶液,平行制备3份;同法制备100%和120%回收率样品溶液;按照2.4节的方法制备样品溶液,按2.2节的方法,分别测定回收率样品溶液、样品溶液和回收率对照溶液的峰面积,按外标法以峰面积计算,四种溶剂回收率试验结果见表3。
表3 回收率试验结果
由表3可以看出,乙醇的平均回收率为99.50%,RSD值为1.78%;丙酮的平均回收率为98.54%,RSD值为1.96%;二氯甲烷的平均回收率为98.89%,RSD值为1.38%;乙酸乙酯的平均回收率为99.14%,RSD值为1.57%。
按照2.4节的配制样品溶液,顶空条件下平衡进样,记录色谱图。按外标法以峰面积计算PLGA中乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的含量。三批样品的测定结果见表4。
表4 三批样品的四种残留溶剂的检测结果
按照《中国药典》2015版四部通则“药品中常见的残留溶剂及限度”要求,乙醇、丙酮和乙酸乙酯的限度均为0.5%,二氯甲烷的限度为0.06%。由表4可知,三批样品的乙醇、丙酮和乙酸乙酯残留量均低于0.5%,二氯甲烷残留量低于0.06%,表明样品中有机溶剂残留得到有效控制。
PLGA作为生物医学材料应用广泛,其合成过程中无论单体经重结晶提纯、还是聚合物经溶解-沉淀法提纯以除去催化剂或小分子残留物、未反应单体等,均会引入有机溶剂,常用的溶剂有二氯甲烷、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。本研究采用顶空气相色谱法,对PLGA中各溶剂的残留量同时进行了测定,建立了溶剂残留量测定方法。
方法学研究中,选择了二甲基亚砜作为溶剂,该溶剂不仅其沸点远高于4种待测溶剂,而且对PLGA溶解性较好。气相色谱图(图2)表明,二甲基亚砜与各溶剂的色谱峰分离良好,对各溶剂测定无干扰,同时各溶剂间的分离度均大于1.5,说明本色谱条件专属性良好。其次,对色谱条件中的顶空瓶平衡时间进行了研究,结果表明,选择20 min较适宜。此外,乙醇、丙酮和乙酸乙酯均在0.2 ~1.5 mg/mL范围内与各自峰面积线性关系良好,二氯甲烷在0.024~0.18 mg/mL范围内线性关系良好,各溶剂检测限和定量限分别在0.09~0.31 μg/mL和0.16~1.17 μg/mL,精密度RSD均小于2%,回收率在98.54%~99.50%,RSD均小于2%。研究表明,该方法专属性强、重现性好、灵敏度高,可用于生物可降解聚酯PLGA中乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯残留量的测定。
采用建立的方法,对自制的两批PLGA50/50和一批PLGA75/25样品进行检测,结果三批样品中乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯的残留量均在药典规定的安全限度内,实现了对自制PLGA材料中溶剂残留量的准确检测,使各溶剂残留量控制在安全限度内。