高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中啶虫脒残留

杨帆 ，李璇 ，2，司升云

（1.武汉市农业科学院蔬菜研究所，430345；2.华中农业大学植物科学技术学院）

啶虫脒（acetamiprid）是继吡虫啉和烯啶虫胺后发现的第3个优良的氯化新烟碱类杀虫剂[1]。该药剂作用于昆虫纲神经系统后突触的乙酰胆碱受体，有触杀、胃毒和较强的渗透作用，杀虫广谱、持效期长、内吸性强，在土壤中稳定性好[2,3]。啶虫脒的作用机制与传统的有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类不同，故对传统杀虫剂有抗性的害虫有特效，是有机磷酸酯类农药的有效代替品[4]。近年来，啶虫脒在黄瓜等蔬菜作物上广泛应用，欧盟目前规定的啶虫脒在果菜类蔬菜中的最大残留限量值（maximum residue limit，MRL）为0.3 mg/kg，日本规定其在黄瓜上的MRL值为5 mg/kg，我国在GB 2763-2019中最新规定啶虫脒在黄瓜中的MRL值为1 mg/kg[5]。在国家对啶虫脒生物安全性评价及残留限量标准进一步规范后，啶虫脒残留分析的检测方法也需进一步完善。

目前啶虫脒残留分析的常用检测方法有气相色谱法（gas chromatographic，GC）[6，7]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8，9]和气相色谱-质谱法 （gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）[10～12]，但这些方法多需要其他手段辅助，操作过程较为复杂。液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）使得农药残留测定的精确度更高，逐渐成为农药残留分析发展的新趋势。但是LC-MS技术成本较高，而且此方法普遍存在基质效应，如果在样品前处理、内标使用、色谱分离和质谱分析等过程中参数选择不当，会直接影响该方法的灵敏度和精确度。已有研究使用液质联用技术对茶叶中啶虫脒进行残留分析[13～15]，也有该技术在大田作物[16]及果蔬[17～20]农药残留测定中应用的报道。本研究采用高效液相色谱-串联质谱法 （high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 测定了黄瓜植株、果实和土壤中的啶虫脒残留，对样品前处理方法进行了改良，并建立了基于定量离子的多重反应监测模式，该方法操作简便、准确性高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啶虫脒标准品（Sigma公司）；20%啶虫脒可溶性液剂（上海生农生化制品股份有限公司）；色谱级甲醇（Tedia公司）；十八烷基键和硅胶吸附剂C18、乙二胺基-N-丙基吸附剂PSA、石墨化炭黑吸附剂GCB、乙腈、乙酸、甲酸（国产色谱纯）、无水乙酸钠、无水硫酸镁、乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY UPLC高效液相色谱仪（Waters公司）；Xevo TQ 质谱仪（Waters公司）；台式高速离心机（德国SORVAL公司）；AR5120电子天平（美国AHOMS公司）；IKAT18匀浆机 （德国IKA公司）；UYC-200全温培养摇床 （上海新苗医疗器械制造有限公司）；氮吹仪（杭州米欧仪器有限公司）；超绿16型背负式手动喷雾器（西班牙MATABI公司）。

1.3 试验方法

①样品前处理 准确称取10.00 g（精确至0.01 g）已均质的样品于50 mL离心管，加入3颗玻璃弹珠及 15 mL 乙腈（含 1%乙酸，乙腈∶乙酸=99∶1），涡旋振荡2 min，加入1 g无水乙酸钠和4 g无水硫酸镁的混合萃取填料，迅速手摇震荡30 s至充分混匀；3 800 r/min离心3 min，取6 mL上清液于15 mL离心管待净化；向提取液中加入300 mg PSA、300 mg C18、22.5 mg GCB、900 mg 无水硫酸镁，涡旋震荡30 s；3 800 r/min 离心 3 min，取 1.5 mL 上清液于10 mL玻璃试管中；55℃温浴氮吹至溶液近干，而后以甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待UPLC-MS/MS检测。

②标准溶液配制 以甲醇为溶剂配制梯度为2、5、20、50、200、500、1 000 μg/L 的啶虫脒标准溶液。

③色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温 40℃。流动相 A：98/2=水/[甲醇（V/V）+0.05%甲酸+5 mmol/L乙酸铵]；流动相 B：乙腈；流速 0.3 mL/min；进样量5 μL；样品室温度10℃。液相梯度参数见表1。

④质谱条件 电离方式为电喷雾电离 （ESI）正负离子切换；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150℃；锥孔反吹气流量50 L/hr；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量800 L/hr；监测模式为多重反应监测（MRM）模式。质子化的选择反应监测条件（[M+H]+）见表2。

表1 液相梯度参数

表2 质子化的选择反应监测条件（[M+H]+）

1.4 实际样品检测

按照本方法检测啶虫脒在大棚黄瓜果实和土壤中的残留量。

①小区设计 设残留低剂量处理区和残留高剂量处理区，以生产中20%啶虫脒可溶性液剂叶面喷雾法防治黄瓜瓜蚜的推荐剂量 （有效成分72 g/hm2）和2倍推荐剂量（有效成分144 g/hm2）分别作为最终残留试验的低剂量和高剂量。每个处理3次重复，每次重复为1个小区，每个小区面积15 m2，各小区之间设保护行。设空白对照小区，并与处理区设有效隔离带，以避免药剂的挥发、漂移和淋溶污染。

表3 啶虫脒在黄瓜样品中的加标回收率和相对标准偏差

②施药方法及样品采集 于瓜蚜发生盛期开始施药，间隔期10 d，共施药3次。最后1次施药后1、2、3、5、7 d分别采集黄瓜果实和土壤样品，用于啶虫脒含量测定。每个小区随机采集成熟、健康、无病害果实不少于2 kg，去除果梗后装入自封袋；用土壤取样器随机采集0～10 cm深的地表土，每小区设3个取样点，总取样量不少于1 kg，去除杂质后装入自封袋。所有样品携至室内采用四分法缩分后各留样200～500 g，用锡箔纸包好装入自封袋，保存于-20°C低温冰箱中，待测。

2 结果与分析

2.1 提取净化方法改良

乙腈是农药提取最常用的溶剂，对多种有机农药的提取效果都十分明显，本试验采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黄瓜中啶虫脒，改用无水乙酸钠和无水硫酸镁去除水分，除加入C18、PSA填料净化外，改良加入GCB对提取液吸附净化，最后以氮气吹扫方式浓缩样品。这种方法流程简便，提取过程中对待测物损失较小。

2.2 质谱条件的选择

啶虫脒为弱酸性烟碱类化合物，适宜选择正离子模式进行检测。啶虫脒共检测223/126.0和223/56.1共2个碎片离子，其中223/126.0选为定量离子，以该离子检测响应值对样品中啶虫脒定量；223/56.1碎片离子为定性离子。

2.3 线性关系的确定线性范围与灵敏度

将配制的系列标准溶液在优化的色谱和质谱条件下进行检测，检测结果以峰面积Y对质量浓度X（μg/L）作校准曲线，结果如图1所示。啶虫脒在2～1 000 μg/L浓度范围内线性关系良好，校正曲线为Y=939.092 X+62.353 1，相关系数（R2）大于 0.999。 定量限为 0.25 μg/kg，检出限为 0.05 μg/kg。

图1 啶虫脒在浓度范围内的校准曲线

2.4 回收率与准确度

本方法中啶虫脒检出限低于MRL值（1 mg/kg），因此设置添加水平为0.5倍、1倍和2倍MRL值，即以黄瓜空白样品中添加500、1 000、2 000 μg/kg 3 个水平的啶虫脒进行回收率试验。每个添加水平进行6次重复。表3结果表明，平均回收率为88.8%～106.6%，相对标准偏差 （RSD）为2.3%～7.0%，符合GB/T 27404-2008中回收率范围在80%～110%的规定。说明此方法的回收率较高，符合残留分析要求。黄瓜样品空白及最低添加水平的样品添加的多反应监测色谱图见图2。

2.5 实际样品检测

在建立了啶虫脒的HPLC-MS/MS定量分析方法及相应的样品前处理技术后，按本方法检测了啶虫脒在大棚黄瓜果实和土壤中的残留量。结果表明，黄瓜果实中啶虫脒的最终残留量范围为0.012 1～0.048 5 mg/kg，土壤中啶虫脒的最终残留量范围为0.000 5～0.050 9 mg/kg。说明该方法精度较高，完全能满足实际检测需要（图3）。

图3 啶虫脒低剂量和高剂量处理下在黄瓜果实（a）和土壤（b）中的最终残留量

3 结论

本研究采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黄瓜中啶虫脒，提取效果十分优良。提取液改用无水乙酸钠和无水硫酸镁去除水分，除加入C18、PSA填料净化之外，改良加入GCB对提取液吸附净化，最后以氮气吹扫方式浓缩样品。这种方法流程简便，提取过程中对待测物损失较小，提取物更加纯净，不用过多的净化步骤就可准确测出大部分痕量待测物，大大缩短了单个样品的检测时间。质谱采用ESI为离子源，经MRM监测模式扫描，选定223/126.0为定量离子，以该离子检测响应值对样品中啶虫脒定量，最大程度的降低了基质干扰对定量分析的影响。检出限为0.05 μg/kg，具有很高的准确度和精密度，且在2～1 000 μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，平均添加回收率为88.8%～106.6%，相对标准偏差为2.3%～7.0%，实际样品检测精度可达0.001 mg/kg，符合国家残留分析方法测试要求。