猪精液稀释液的配制、消毒及检测技术

吴德标 （江苏省盐城市盐都区家畜改良站 224056）

在现代猪的人工授精操作过程中，造成精子死亡的主要原因除了精子本身先天性的脆弱和衰老而外，稀释液的优劣是关系到精液体外存活时间长短的一个非常重要的因素，精液的稀释不仅是增加精液的容量，还在于能使精液经过较长时间的保存和较长距离的运输后仍能继续使用。因此，养猪场如何进行猪精液稀释液的配制、消毒及检测工作，显得十分重要，实际操作务必做到严肃认真，一丝不苟。笔者结合自身工作实践，在具体操作过程中，应切实注意以下四个方面。

1 配方与药品

稀释液配方种类很多，总的来说，稀释液的配方是由简单到复杂，然后又从复杂回归到简单，使用的配方(葡萄糖—柠檬酸钠液)就是一种比较简单的配方，具有取材容易、配置方便、价格较低、效果较好等优点。配置稀释液的各类药物原料品质要纯净，尽可能选用化学纯和分析纯制剂，以尽量减少药品原料中的杂质对于精液保存的影响。

1.1 葡萄糖

用来补充精子代谢过程中消耗的能量，由于精子代谢只是单纯的分解作用，而不能通过同化作用把外界物质变成自身的成分，所以只能使用最简单的能量物质,葡萄糖即是其中之一，由实践得知，用注射用的葡萄糖为好，比例占5%～6%。

1.2 柠檬酸钠

柠檬酸钠是一种缓冲物质，用于维持经验相对恒定的pH值，避免精子代谢产物对于精液品质的影响，市售品为柠檬酸三钠或枸橡酸钠，由于本品用量较小，故意使用分析纯的为好。比例占0.3%～0.5%。

1.3 乙二胺四乙酸二钠

本品具有保护精子抗冷休克的作用，又能改变精子细胞膜的通透力来降低精子的果糖分解，抑制精子的活动，从而延长精子的寿命，同时也是一种螯合剂，可以使精液稀释液中所含不利于精子存活的一些金属离子变成稳定的络合物，以减少对精子的伤害。生产上常用乙二胺四乙酸二钠，本品以用分析纯为好，比例占0.1%。

1.4 水

宜用纯净新鲜的蒸馏水。水质的好坏也是稀释液质量优劣的决定性因素之一，所用蒸馏水最好是自制的，要符合药典标准。

1.5 抗生素

采取的精液难免要被一些细菌和有害微生物污染，因此必须在稀释时加入一定的抗菌物质，来抑制细菌及有害微生物的生长繁殖。多年的实践证明用庆大霉素能有效地抑制细菌，并对精子无伤害作用。用量为1万IU/100ml。

2 药物的称量和溶解

一般配置稀释液时都用天平来称取药品，用量杯来量取水，需要注意的是，称、量一定要准确无误。所有药品必须充分溶解，特别是乙二氨四乙酸二钠和柠檬酸钠这些比较难溶解的药品，配制时可以分两步进行，第一步是把所称的药品放入锥形瓶内，加入适量蒸馏水加热使之充分溶解；第二步再加入蒸馏水定容到所需要的量，并且充分搅拌均匀。配置好的稀释液必须进行过滤，保证能把所有的杂质完全过滤掉，严格防止过滤过程中蚊、蝇、蚂蚁等昆虫的污染。

3 稀释液的消毒

（1）稀释液本身是一种培养基，如被细菌污染，造成的后果是可想而知的，因此，配置好的稀释液必须进行严格的消毒灭菌。以高温高压灭菌效果为最好，采用高压消毒锅来进行稀释液的消毒灭菌工作。（2）使用时可将稀释液装入500ml洁净的盐水瓶里，塞上瓶塞并用纱布块包裹扎好扎紧，依次放入内胆中，盖上锅盖，拧紧环状压盖螺帽，关闭放气阀，接通电源进行加热。当压力升到0.3kg/cm2(约合4.2磅)时打开放气阀，放出高压锅内冷气，使指针回落到0位，然后再关闭放气阀，继续加热。当压力重新上升达到0.7kg/cm2(10磅)时，此时锅内温度已经达到115℃，可通过控制电源的开关来维持锅内的压力和温度，使之恒温恒压维持0.5h，然后打开放气阀慢慢放气，使指针再冷回落到零位时打开锅盖，取出稀释液瓶冷却备用。

4 稀释液的检测

消毒好的稀释液必须经过检测合格后方能交付使用，检测主要使用二种方法：

4.1 pH测定

（1）pH的变化，对精子的活动力和代谢的影响都很大，在18～20℃室温条件下，当pH为6.4精子处于可逆性的“休眠”状态，所以稀释液的pH宜在6.4～6.5之间。（2）测定稀释液应在消毒后待温度降至室温时测定，可用pH6～8精密试纸进行测定，以稀释液滴在试纸上半秒钟内与标准比色板比较，得出pH，有条件时也可用酸度计测定，用酸度计测定时要注意校正温度并正确进行酸度计的标定，以免误差。

4.2 渗透压测定

（1）渗透压对于精子来说有着与pH相同的重要性，通常要求稀释液与精液保持等渗，渗透压出现异常时会损害精子的代谢和活力，一般来说低渗比高渗有更大的危害性。（2）测定渗透压用贝克曼温度计(示差温度计)来测定稀释液的冰点下降度(△t)，然后再除以一个常数1.86来计算出克分子浓度(即渗透压)。纯水在0℃开始结冰，0℃是纯水的冰点，但当水中溶解有其它物质时就不会在0℃时开始结冰而在0℃以下的某一个温度点时开始结冰，而且随着这种溶质的浓度升高而开始结冰的温度点(这种溶液的冰点)也就逐步降低，这种溶液的冰点与纯水之间叫冰点下降度，常用△“ t”来表示。（3）用贝克曼温度计测定公猪精液，稀释液时的具体操作步骤如下：

4.2.1 器材的准备 需要准备的器材有，贝克曼温度计一支，滴定台一架，1000ml量杯一只，冰若干，粗盐若干，铁丝圈一个，20×15试管若干支。将冰块置于1000ml量杯中上面撒些粗盐，洗净的试管加入蒸馏水，插入冰块中降温后备用。

4.2.2 温度计的调整 （1）贝克曼温度计是一只长56cm的玻璃管制成的，玻璃内部上下各有一个水银泡，中间有从0～5的刻度，每一刻度间又分成100等份，上端水银泡为—U状细管，内有贮备水银，通过球状阀可与下端水银泡相通，以便调节下端水银泡水银的多少。（2）调整时手握温度计，使温度计倾斜呈倒置状态，同时转动温度计使U型管中的水银与温度计顶端的球形阀相接，然后用另一手掌握住下端水银泡(由于温度计处于倒置状态，故此时下端水银泡在上方)，借助手温使水银柱上升并通过球形阀与U型管中的贮备水银相接通。水银的多少调节好后，可用左手握温度计的上部，并用右手中指轻轻碰击温度计，使U型管中的水银与球状阀连接点断开。

4.2.3 温度计的安装 将温度计调整好后固定在滴定架上，温度计的下方装有一个可以上下移动的1000ml量杯，量杯中放置冰块，冰块上撒些粗盐，并将20×15试管置于冰块中待用。

4.2.4 测定纯水的冰点 （1）在试管中加入待测的蒸馏水，水的多少以浸没温度计下端水银泡为度，将铁丝圈放入试管中，并将温度计下端水银泡插入试管中使被水浸没。此时不停地用铁丝圈上下搅动试管中的蒸馏水，使之温度均匀下降，观察温度计时水银柱会渐渐降低。（2）由于任何溶液在开始结冰的一瞬间会释放出能量来，因此，当试管中的水开始结冰时，水银柱会停止下降而突然上升，此时必须观察，直至水银柱停留在某一刻度上一段时间不再上升时，此时所读取的数值即为纯水的冰点，由于贝克曼温度计上的刻度不是指示实际温度，而是所测溶液冰点的相对刻度值(即贝克曼温度计零点)，而其零点与下端水银泡中的水银多少有关，所以每进行一批次测定都要重新调整温度计。在连续测定三次纯水冰点后，其读数值末位之差不超过3时，取其平均值，当读数值超过3时，则应重做。

4.2.5 测定精液与稀释液 在测得纯水冰点后，即可进行稀释液(或精液)的测定，测定的方法同上。测定完毕取出贝克曼温度计时，往往试管中的溶液已结冰，此时取出温度计要小心，要用手握试管底部，待冰融化后将温度计取出，切勿硬拉，以免损坏温度计。每测完一种溶液后，需将温度计下端擦拭干净，所用试管先用被测溶液冲洗一下，以免影响测定结果。使用完毕，应及时将贝克曼温度计擦拭干净，并轻轻将温度计倒置，使下端水银泡中的水银向U型管中回流一些，然后置盒中保存。

4.2.6 计算冰点下降度 纯水3次冰点平均值t；所测溶液3次冰点平均值t’；冰点下降度△t=t-t’。