循环肿瘤DNA在肿瘤液体活检中的应用及临床意义*

祝小荐，万绍贵

(赣南医学院分子病理中心，江西 赣州 341000)

癌症是威胁人类生命健康的主要疾病，据世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IARC)2018年估计，仅2018年一年高达960万人死于癌症，且全世界罹患癌症的人数还在迅速增长。最主要的原因之一是无法获得精准的检测和治疗。准确评估肿瘤的内在分子特点对于采取临床有效的治疗方法至关重要，分子诊断技术的进步有助于揭示肿瘤的内在特性。

临床上，组织活检仍是评估大部分肿瘤特异性改变的主要手段[1]。组织活检通常取自原发性肿瘤组织，取样方法往往具有侵袭性，且由于肿瘤自身的异质性，使其不能准确追踪肿瘤的动态变化。基于组织活检的肿瘤评估具有很大的局限性，开发新的检测方法是解决肿瘤危害的关键。临床上，迫切需要使用非侵入性或微创方法，对肿瘤患者的基因组变化进行系统和实时监测。随着分子生物学的发展，液体活检技术应运而生，提供了一种非侵入性的、可重复取样的便捷手段，应用于肿瘤患者的辅助诊断、个体化治疗、疗效监测以及跟踪预测耐药性突变和预后的评估等领域。

液体活检，是基于血液或其他体液样本的非侵入性技术。来自癌症患者的体液样本的液体活检包含完整的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTCs)、细胞来源的囊泡 (如外泌体)以及来自肿瘤细胞的游离RNA和DNA等。这些都是评估肿瘤特异性可靠的样本来源，且由于液体活检的无创性，只要有必要，就可重复取样，以便于实时观察肿瘤内部的动态变化。cfDNA起初在健康人的血液中被发现[2]，然而未被重视。直至1977年， Leon等[3]研究者发现循环血液中游离DNA (circulating cell-free DNA cfDNA)浓度在淋巴瘤和肺、卵巢、子宫、子宫颈等肿瘤患者中升高。10年后，Stroun等[4]研究发现，肿瘤患者较健康人血液中存在更为丰富的cfDNA。 1989年，研究者报道了在癌症患者的cfDNA中检测到与肿瘤基因组变化一致的片段[4],ctDNA首次进入人们的视野。ctDNA是一种存在于血液中的cfDNA,它是起始于肿瘤细胞。通常，在体内大多数肿瘤细胞都会释放出一些自身携带的DNA。普遍的说法是认为ctDNA拥有多个起源，最常见的是：(1)凋亡或坏死的肿瘤细胞，(2)活的肿瘤细胞，(3)循环的肿瘤细胞[5-7]。CTCs是从原发肿瘤或转移部位释放进入血液的肿瘤细胞。相对于基于ctDNA的分析，CTCs捕获的复杂性和高成本可能会限制其应用[8-9]。同时，作为生物标记物的ctDNA检测比CTCs检测具有更高的敏感性[10]。而且，ctDNA的半衰期短，15分钟到几小时不等，在血浆中呈动态性的变化。且由于ctDNA的改变与肿瘤基因组一致，ctDNA可能是肿瘤基因组的潜在替代物，可以利用ctDNA实时监测肿瘤基因组的变化，在肿瘤学的研究中极具潜力。

1 ctDNA检测方法

血液作为液体活检最主要的样本来源。在血清中，cfDNA的含量可能是血浆中cfDNA含量的2～24倍[11-12]。但血浆的应用性依然优于血清，主要是血清制备过程中可能会增加野生型DNA水平，且血浆中cfDNA突变量高[13]，对肿瘤的突变分析更占优势。尽管cfDNA含量在癌症患者体内高于健康人，但是，由于肝脾肾的清除作用，cfDNA释放到循环的含量依然很低，来源于肿瘤细胞的ctDNA比例更可能低至0.01%[14]。因此，ctDNA的标准化分析检测对液体活检的临床应用至关重要。随着分子技术的发展，很多方法可以用于ctDNA的分析检测。结合快速微流控分析的数字PCR显著提高ctDNA检测的敏感性，可以对核酸进行绝对定量[15]。在Bettegowda[10]的一项大型研究中，采用数字PCR评估ctDNA检测肿瘤的能力，75%晚期卵巢癌、结肠癌、膀胱癌等以及50%原发性脑癌、前列腺癌、肾癌可被检出。cheng[16]也采用液滴数字PCR (ddPCR)技术检测188例转移性胰腺癌患者的基因突变。此外，结合了数字PCR以及流式技术的BEAMing分析对ctDNA突变检测也有较高的敏感性。Li等[17]曾利用甲基化-BEAMing准确测定样品DNA中甲基化分子的数量。Krug等[18]研究也发现经BEAMing分析检测ctDNA EGFR激活的敏感性为82%，对EGFR T790M突变的敏感性为84%。此外，高通量测序(NGS)、全基因组测序(WGS) 、全外显子组测序(WES)及ARMS等均是检测ctDNA的可行方法。

2 ctDNA在肿瘤个性化治疗上的临床应用

液体活检在临床上的应用是多方面的，ctDNA作为一种可以提供肿瘤关键信息，广泛适用于癌症的潜在生物标志物也备受期待(图1)。

图1 ctDNA的潜在应用

2.1评估肿瘤疾病负担Bettegowda评估了大量的癌症类型发现，大多数脑外实体瘤中均可检测到ctDNA(82%)。同时，患者体内ctDNA浓度与肿瘤的类型、分期及进展有关。他们的研究发现局限性癌症患者血浆ctDNA浓度低于转移性癌症患者，晚期癌症患者或转移患者血液循环中，突变DNA片段浓度相对较高[10]。此外，早有研究者发现在转移性癌症患者中ctDNA浓度高于大多数常用生物标志物[19]，而晚期乳腺癌患者与ctDNA浓度也存在类似的联系[20]。脑脊液中ctDNA深度测序也被证明是可以检测脑干肿瘤特异性改变的可靠技术[21]。Spina等[22]回顾分析了349例CHL癌症患者血液和组织样本，表示ctDNA确实可以提供肿瘤组织内包括cHL分期及预后在内的关键信息。在结肠癌或胰腺癌中无法治愈的阶段， ctDNA也被发现可能反映晚期癌症的疾病负担。肿瘤的疾病负担是指肿瘤带来的人类各方面的损失，这不止是身体上的，还包括精神以及经济方面的损失等。通常早期患者的ctDNA水平较低，ctDNA大多数在患者疾病中晚期阶段被发现, ctDNA在早期肿瘤患者的丰度是大约10倍低于进展期的患者，还需要进一步改进技术，以达到可接受的早期癌症检测灵敏度。ctDNA的丰度确实与肿瘤发生发展有着密切的联系，这种联系很可能是正相关的，提示其可作为肿瘤疾病负担的替代标志物。

在不同癌症类型和分期中，ctDNA检测出的片段大小也不同。早在20多年前，人们就发现健康人平均血浆DNA长度超过癌症患者[23]。不久前，Mouliere等[24]对来自18种不同癌症类型的患者的344份血浆样本和来自健康对照组的65份血浆样本中生成的cfDNA片段特征分析发现，健康个体血浆和晚期胶质瘤、肾癌、胰腺癌、膀胱癌患者血浆cfDNA片段长度明显长于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、胆管癌等晚期癌症。他们发现对cfDNA片段大小分析和特定片段大小的选择性测序可促进ctDNA检测。Florent等[25]也发现肿瘤来源的ctDNA根据ctDNA片段的大小呈现出特定的量谱。不难发现， ctDNA的总长度始终小于正常无细胞DNA的片段长度。Underhill等[26]的研究也为这结果提供了令人信服的证据。因此，来自各种实体肿瘤的cfDNA和ctDNA在片段长度上的这种细微但明显的差异为ctDNA在实体肿瘤检测和诊断中的临床应用提供了潜在的标志物，且在监测肿瘤复发，评估肿瘤对治疗的反应上也有一定的价值。

2.2监测治疗反应诊断出癌症后，制定合适的治疗管理方案是最重要的一环。肿瘤个性化治疗的一个重点，在于干预特定突变驱动信号。由ctDNA定义的大多数常见突变已经被用于监测癌症患者的治疗，包括肺癌EGFR基因突变、结直肠癌KRAS基因突变、乳腺癌TP53、PIK3CA基因突变、前列腺癌AR基因突变等。例如，Murtaza[27]和他的同伴为探索治疗后转移性癌症的基因组进化，对大量来自血浆样本中的癌症外显子组测序，包括紫杉醇治疗后PIK3CA的激活突变;顺铂治疗后RB1的截断突变;用他莫昔芬和曲妥珠单抗治疗后MED1发生截断突变，吉非替尼治疗后表皮生长因子受体EGFR T790M突变，这些突变表达增加可以解释治疗后出现的耐药性。ctDNA KRAS分析也被证明可以用于监测胰腺导管腺癌(PDAC)患者的治疗反应，且发现其至少与常用的生物标志物CA199作用相当，甚至随着时间推移，比CA199的动态变化更能预测患者生存和预后[28]。研究员们还试图通过ctDNA寻找可靶向治疗的突变，在Spina等[22]的研究中，通过收集了经典霍奇金淋巴瘤(CHL)患者化疗或免疫治疗后以及治疗后复发的纵向标本，来评估治疗带来的肿瘤基因上的改变。另一项研究里，Taus等[29]对33例肺腺癌患者的221份血浆标本进行了分析，在83%的患者和100%的胸外转移患者血浆中检测到EGFR突变。他们分析发现EGFR突变负荷的动态变化可以预测患者治疗反应和疾病进展，而且这种预测发生在放射学评估之前。一些ctDNA标记甚至可以指导肿瘤的治疗，血浆中发现EGFR致敏突变的非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌患者可以用厄洛替尼治疗[30]，血浆T790M阳性的患者可使用奥西莫替尼治疗[31]，野生型KRAS原发性结直肠肿瘤患者可接受EGFR治疗[32]， ctDNA中BRCA2突变的转移性胰腺癌患者被证实对顺铂化疗更为敏感[16]。Wolff等[33]证明以血液为基础的RAS突变试验，可以替代组织RAS检测，确定转移性结肠直肠癌(mCRC)患者是否适合抗EGFR治疗。一项Ⅲ期临床试验也证实，口服表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物厄洛替尼联合吉西他滨可延长晚期胰腺癌患者无进展生存期[34]。Zou[35]也强调了连续ctDNA监测在接受靶向治疗和免疫治疗的NSCLC患者中的潜在临床应用价值。综上可见，ctDNA检测可提醒耐药性突变的出现，并提示治疗中肿瘤状态的改变，有利于监测肿瘤演变以及预测耐药性，为肿瘤患者的精准治疗提供依据。

2.3预后的评估近年来，由于很难获得足够数量和质量的肿瘤组织，且重复活检受到各种条件的限制，给肿瘤治疗的预后研究带来了困难。基于ctDNA的液体活检有助于克服这个困难。在一项前瞻性研究中[36]，ctDNA的存在与晚期胰腺癌较差的总生存率以及手术后较短的无病生存期相关，ctDNA被证明是晚期胰腺腺癌的独立预后标志物。同样，Spina和他的同伴们[22]也发现在ABVD方案(阿霉素、博莱霉素、长春花碱和达卡巴嗪)治疗2个疗程后，完全缓解或治愈的CHL患者比复发患者ctDNA浓度下降更大。不久前， Turner等[37]观察到早期乳腺癌治疗后检测到ctDNA与其复发的高风险相关，且其对所有肿瘤亚型均有预测作用。Coombes等[38]也得到了相似的结果。相关的研究也展示了ctDNA在结直肠癌[39]及黑色素瘤[40]等治疗后复发的预测作用。当然，由于研究样本量小，ctDNA的检测是否对全部癌症都有预后价值还需进一步研究。由于ctDNA的半衰期短，可以动态的监测肿瘤基因组的变化，实时提供分子异常信息。基于ctDNA可发现影响预后的突变，这在很多研究中有所体现。例如Provencio等[41]研究表明EGFR T790M突变等位基因频率与NSCLC患者死亡和疾病进展的风险显著正相关。Zhang等[42]也认为，在随访过程中密切监测EGFR突变，可以预测接受酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向治疗的NSCLC患者的预后。Yam等[43]研究也得到相似的结果。ctDNA中的BRCA逆转突变更是能预测高级别卵巢癌对PARP抑制剂的原发性和获得性耐药[44]。此外，胰腺癌的KRAS突变[16]，非小细胞肺癌的EGFR突变[45]，乳腺癌的HER2[46]等都与不良预后有关。研究证明，ctDNA的功用不止如此，其在预测肿瘤手术后复发与转移上也有足够的潜力，Sausen[47]也通过ctDNA分析比放射成像早6个月发现9例手术后胰腺癌患者的复发。甚至，在1例同时患乳癌与直肠癌的中年女性在接受手术治疗2年后，ctDNA图谱提示与直肠癌样本相同的多种体细胞突变，由此证实了直肠癌复发[48]。Maron等[49]还探索ctDNA基因组改变的分布在进展期胃食管腺癌的预后影响。ctDNA分析可用于评估特定基因、ctDNA负担以及肿瘤内分子异质性，有望成为预后和预测的生物标志物，值得进一步研究。

2.4其他某些特定性突变可提示肿瘤的特殊类型，例如，BRAF癌基因的点突变主要见于甲状腺乳头状癌[50]。p53突变也发现在结肠癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、内皮网癌和造血癌等不同类型的癌症中常见，且p53的突变谱各不相同[51]。对ctDNA中这些突变的分析可以为这些不同肿瘤的病因和个性化治疗靶点提供线索。也有研究探索ctDNA在癌症患者的早期检测上的意义，确实，ctDNA检测有助于对胰腺癌[52]、乳腺癌[37]及非小细胞肺癌[53]等肿瘤的早期诊断，且有可能实现早期预测肿瘤的进化和转移[54-56]。可惜的是早期疾病中ctDNA浓度极低，且循环突变片段起源组织的这种不确定性也为基于ctDNA进行的肿瘤早期检测增加了困难和挑战[57]。

3 困难与挑战

ctDNA作为有意义的生物学标志物，在肿瘤精准医学和个性化治疗上展示了巨大的潜力。ctDNA检测为癌症诊断、监测、预后判断和治疗提供了一种无侵入性、简便易行的方法。更甚之，与传统的检测方法相比，ctDNA检测可以提供更为完整的生物学信息[58]。然而，ctDNA的临床使用上仍然存在困难。如ctDNA的高碎片化和循环中的低浓度，对其定量及检测是一种挑战。其次，方法的标准化、敏感性、与肿瘤组织的一致性、调控问题等需要考虑。同时，不同人的 ctDNA 水平有所差异。对此，需要对可靠的、标准化的ctDNA检测方法达成一致。 第三，cfDNA也被发现在生理和非癌变病理条件下浓度增加，而且，有研究表明，即使是那些从未患过癌症的人，癌症相关的突变也会随着年龄的增长而发生[59]。这对通过ctDNA图谱检测突变和疾病的预判增加了难度。最后，ctDNA检测的成本效益也值得重视，尽管不少公司和实验室在开发这类测试方面非常积极，但其高成本还是限制其临床应用。总之，尽管ctDNA液体活检具有高灵敏和微/无创性等优点，这一领域的发展在癌症的精准治疗中具有广阔的前景，但其完全代替传统检测方法还有很长的一段路要走，其广泛应用在临床前还需进一步探索。