bFGF 基因体外转染缺血性心肌病大鼠骨髓基质干细胞研究

刘效波，荆丽杰，刘宝堂，侯文明，李磊，赵进，李子军

潍坊医学院附属医院心血管外科，山东潍坊 261031

缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy，ICM）属于特殊或晚期阶段的冠心病的一种，心肌慢性缺血主要由冠状动脉粥样硬化导致，心肌细胞弥漫性纤维化或坏死而形成的疾病[1]。 骨髓基质干细胞（bonemar rowstem cells，BMSCs）是一类存在于骨髓中的具有分

化成多种体内细胞潜能的细胞群， 目前是研究的热点，可通过对特定条件的控制诱导其分化成特定细胞或组织[2]。 正是因BMSCs 的可分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能，在体外增殖迅速、易获取等特点，将其作为修复机体损伤治疗用干细胞已逐渐成为研究热点，但研究将其作为基因治疗的靶细胞的却较少[3]。该实验拟将病毒介导的bFGF基因转染体外培养的大鼠BMSCs，观察bFGF 在BMSCs内表达与否及其表达率，并观测转染bFGF 后其细胞增殖及分化等生物学功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠10 只，体重在(180±20)g 左右，由中国医科大学动物实验室提供。 在恒温（24±2）℃、12 h 循环光照的实验环境中，在造模前喂养7 d 以适应新环境。

1.1.2 药品和试剂 胎牛血清（Clark 公司），DMEM 培养基（Hyclone 公司），胰蛋白酶（碧云天公司），bFGF的ELISA 试剂盒（R&D 公司），bFGF 抗体（Sigma 公司）。 bFGF 片段(武汉博士德生物)，细胞转染试剂盒(美国R&D 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ICM 模型的制备 根据文献[4]大鼠ICM 模型的制备采用冠状动脉左前降支结扎法。首先用水合氯醛注射液麻醉大鼠，然后通过呼吸机连接气管对其进行插管以保持呼吸顺畅。从大鼠左侧的胸骨第4 根肋骨间打开胸腔以暴露心脏，冠脉左前降支走行于左心耳与动脉圆锥之间深处，利用无创小圆针7-0 丝线将心脏结扎，可见左室前壁因缺血出现紫绀，心电图显示ST 段弓背向上抬高。 从造模开始到造模后喂养期间，大鼠死亡数别是3 只。

1.2.2 BMSCs 的提取与培养 大鼠造模成功后断颈处死，75%乙醇中浸泡灭菌。 后续操作均在超净工作台中进行。取出股骨将两端剪除，将骨髓腔暴露。骨髓腔用PBS 缓冲液清洗3 遍，室温下离心（1 000 rpm/min，20 min），弃上清液，加入1 mL 10% FBS-DMEM 完全培养液制成细胞悬液，将其加入培养瓶中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养， 根据细胞生长状态每隔2～3 d 进行换液。 当细胞铺满培养瓶底部约80%时可进行传代操作。

1.2.3 基因转染 取第2～3 代的大鼠BMSCs 进行以下操作。将培养好的BMSCs 消化离心，台盼蓝染色对活细胞进行计数。于六孔板每孔中加入密度为1×105/mL的细胞悬液2 mL， 培养箱中稳定过夜， 当细胞达到60%～80%融合， 于转染前1 天弃去原培养基换无血清培养1 d。 按转染试剂操作说明书进行转染。 将细胞培养皿中的原培养液吸出， 每孔加入200 μL ENI.S， 将病毒稀释至终浓度为1×1011TU/L， 每孔加入Polybrene 至终质量浓度为5 mg/L，孵育12～24 h。 后吸弃液体，加10%FBS-DMEM 完全培养液继续培养。

1.2.4 ELISA 法检测bFGF 表达 6 孔板底部预先铺好用于免疫荧光检测的玻片， 于每孔中铺入密度为1×105/mL 的转染bFGF 后的BMSCs 作为转染组，每孔加入2 mL。分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h分别提取1 mL 的大鼠BMSCs 培养上清液。在各时间点分别吸取1 mL 上清至事先灭菌并做好标记的EP管中 （提取后补加完全培养液1 mL），1 000 rpm/min离心15 min， 吸取上清加入新EP 管中， 编号后于-80℃超低温冰箱保存备用。 利用ELISA 检测bFGF 蛋白表达，试剂应按瓶上标签说明储存，使用前室温平衡。对照组接种的细胞为未处理的BMSCs。后续操作参照ELISA 试剂盒说明进行。

1.2.5 免疫荧光方法检测 将ELISA 实验中事先铺好的盖玻片取出，PBS 缓冲液清洗3 次，4%多聚甲醛液固定15 min 后，再次清洗；1%牛血清白蛋白封闭30 min，按照说明书对抗体进行稀释， 加入稀释后的一抗bFGF 孵育100 min， 重复清洗；1%BSA 封闭30 min；加二抗孵育40 min 后清洗；DAPI 复染细胞核后清洗并封片。 操作时注意避光。

1.2.6 免疫组化染色 将BMSCs 涂片用多聚甲醛中固定30 min，封闭，加入山羊血清50μL 室温孵育20min。再加入稀释后的bFGF 一抗100 μL 于37℃孵育2 h，再加入通用型IgG 抗体-Fab 段-HRP 多聚体50 μL室温孵育30 min。 DAB 溶液显色，复染，脱水，封片后于显微镜下观察。 以转染空白质粒为正常组，以未转染为阴性组。染染效率=（bFGF 表达阳性的细胞数/计数细胞总数)×100%。

1.2.7 CCK-8 法测增殖活性 将转染后的BMSCs 重悬成5×103/mL 的细胞悬液以每孔100 μL 的体积种到96 孔板中作为转染组。 培养箱中诱导24 h 后用CCK-8 试剂检测细胞增殖能力的变化。 取出96 孔板， 以每孔10 μLCCK-8 的体积加入96 孔板中后继续孵育2 h。 后将96 孔板置于酶标仪中在波长450 nm处读取吸光度值（A），6 个复孔的平均值用来表示测量结果。

1.3 统计方法

采用SPSS 23.0 统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用t检验，P＜0.05 为差异统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs 的体外培养

在培养24 h 后大鼠BMSCs 开始贴壁，逐渐开始伸展呈长梭形或者三角形，并出现小集落样生长，d9～11 可铺满培养瓶底部80%左右。 经台盼蓝染色得活细胞比率约为97%。 计算细胞倍增时间约为53.6 h。通过生长曲线可知原代大鼠BMSCs 的生长期缓慢，随后进入对数生长期并在d7～9 内持续旺盛的增殖，并转入平台期，增殖活力与对数生长期相交减缓并趋于稳定。 经bFGF 转染后BMSCs 的增殖活性被进一步活化，细胞倍增时间减少，缩短至48.3 h，使细胞的增殖能力增加，细胞形态增大。

2.2 培养上清液中bFGF 浓度的测定

在不同时间点取培养上清，ELISA 法检测其中bFGF 的分泌水平。 在60 h 时可达到最高分泌浓度，累计可达到(19.702±0.074)ng/mL，其后随着时间增加而浓度有所下降，见表1。

2.3 免疫荧光法检测bFGF 表达

利用免疫荧光染色对BMSCs 不同时间点表达bFGF 情况进行观察， 结果发现在胞浆中出现较多的棕黄色颗粒，表明胞浆中有bFGF 的存在，并随着时间推移逐渐增加，60 h 时含量最多，随后逐渐减少，而这种浓度的变化趋势大致类似于ELISA 法中检测的bFGF 变化趋势。 而空白组则无明显的染色。

2.4 免疫组化检测bFGF 表达

镜下可见转染细胞表达bFGF 呈阳性，其表达部位在胞浆，细胞胞浆染成黄褐色。 转染组bFGF 表达率最高可达为(72.19±8.83)%， 对照组阳性表达率为(19.82±2.54)%，两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组bFGF 在大鼠BMSCs 中的表达比较[（±s），%]

表2 两组bFGF 在大鼠BMSCs 中的表达比较[（±s），%]

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别阳性率对照组转染组t 值P 值19.82±2.54（72.19±8.83）*9.872＜0.05

2.5 CCK-8 法测大鼠BMSCs 增殖活性

转染后的和为转染的大鼠BMSCs 分别以每孔5×103的密度接种于96 孔培养板中培养24 h 后，CCK-8 法检测其增殖活性。 与空白组相比，转染组能显著促进HUVEC 细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

3 讨论

表1 两组大鼠BMSCs 不同时间点bFGF 分泌水平比较[（±s），ng/mL]

表1 两组大鼠BMSCs 不同时间点bFGF 分泌水平比较[（±s），ng/mL]

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别对照组转染组P 值t 值12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 0.284±0.161(3.522±0.324)*9.633×10-5 15.501 0.593±0.215(5.991±0.323)*0.002 24.096 1.058±0.332(8.419±0.115)*2.965×10-6 36.146 1.977±0.123(13.014±0.313)*7.390×10-7 56.844 1.080±0.252(19.702±0.074)*7.883×10-7 122.808 0.534±0.098(11.935±0.203)*1.292×10-7 87.556

ICM 属于冠心病的晚期阶段，由于心肌缺血而引发的心力衰竭、心脏扩大的临床症状，其主要临床表现为心绞痛、心力衰竭、心律失常、血栓和栓塞，劳力性呼吸困难等[5]。 ICM 对人类健康和生活带来严重影响，其发病率和致死率持续增加[6]。该实验旨在探究体外培养大鼠BMSCs 后用病毒携带bFGF 转染细胞，观察其生物学功能的变化， 为临床ICM 的治疗提供新思路。

BMSCs 首先由Friedens tein 等于1986 年提出的具有分化成多种细胞潜能及自我更新能力的一类干细胞。 因其具有的分化潜能，通过控制特定的诱导条件，使BMSCs 向骨、肌腱、肌肉或关节等多种组织进行分化[7]。 当机体存在损伤区时，四周的BMSCs 可迁移至该区域，促进受损区域的修复或愈合。目前，基因水平的治疗方案随着基因工程技术的快速发展，被广泛应用于在组织工程。而BMSCs 因其来源范围广，易得取、分离、培养和增殖，多向分化潜能，易实现自体移植， 减少异体移植的排斥反应的低或无免疫源性，易于被外源基因转染并稳定表达等优点，已成为转基因技术种子细胞的首选， 然而移植后BMSCs 存活率过低的问题一直未被解决[8]。 为解决该问题相关研究工作者进行了大量的研究， 结果证实低传代接种密度、 低糖培养基和bFGF 的使用均能够促进BMSCs的增殖[9]。 因此，在该实验中，选取bFGF 基因对BMSCs 进行转染。 获取BMSCs 的方法主要包括全骨髓培养法、密度梯度离心结合贴壁培养法及流式细胞术分离法。 王雪[10]利用离心法结合贴壁培养法获取了大量的可传代的原代BMSCs， 经流式细胞仪的检测CD44 阳性表达率高达99.96%，其结果与该研究一致，说明离心法结合贴壁法可用于原代BMSCs 的提取，而在该实验中以此方法进行BMSCs 的提取且提取的BMSCs 经鉴定纯度均大于99.9%可用于后续实验。

成纤维细胞生长因子 （fibroblast growth factor，FGF）是由内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等多种细胞分泌，有酸性和碱性两种形式，同分异构体多样，对多种细胞游走或增殖等生物学功能，血管新生，受损细胞的修复如软骨与骨的愈合等均具有促进作用，在机体的创伤愈合或肢体再生中发挥重要作用[11]。 FGF可以加速病灶的产生，但从修复角度看它也有有利的一面。 FGF 具有促进细胞有丝分裂，诱导细胞的形态改变和分化的作用，在生理或病理状态下都能够参与机体的生长发育和组织损伤的修复过程。 bFGF 是FGF 重要组成部分，对来源于中胚及神经外胚层细胞的增殖能力具有促进作用的细胞分泌物质。 bFGF 对于BMSCs、血管内皮细胞或成骨细胞等的增殖，抑制其分化成熟，分裂及修复具有不可替代的作用。 bFGF对在极底的浓度时（低至1 ng/mL）中对胚层及神经外胚层来源的细胞任然具有强大的的促有丝分裂作用[12]，能加快BMSCs、成纤维细胞等的分裂，增殖和分化能力，因此其在组织愈合及修复中具有巨大的潜能。 研究发现浓度为1 ng/mL 的bFGF 可抑制肌肉细胞分化，抑制率可达49%，当bFGF 浓度增加至10 ng/mL时，抑制率高达80%[13]。 该实验中bFGF 的表达随着时间的增加含量逐渐增多， 并在60 h 累计含量达到最高，可达(19.702±0.074)ng/mL，其最低分泌浓度均>1 ng/mL，说明将其转染入BMSCs 后能够有效促进其增殖及分化。

表3 两组大鼠BMSCs 不同时间点细胞增殖活性变化情况比较[（±s），%]

表3 两组大鼠BMSCs 不同时间点细胞增殖活性变化情况比较[（±s），%]

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h对照组转染组P 值t 值100.4±0.2（104.1±0.9）*0.002 6.951 101.9±1.5（109.8±0.5）*0.001 8.654 102.6±0.4（113.5±1.1）*8.6422×10-5 16.130 105.6±1.1（118.9±0.8）*7.126×10-5 17.342 102.7±1.0（124.3±1.2）*0.000 23.951 101.3±0.3（113.8±1.5）*0.000 14.153

病毒载体对分裂期及非分裂期细胞均具有感染作用，能使目的基因进入靶细胞并能够稳定长期得表达，可向同一细胞引入多种基因，或对同一细胞进行对此转染，不易引起靶细胞的免疫反应，生物学安全性也较高。 该实验采用病毒转染的方法操作简单，目的基因的表达在一定的时间内保持稳定的表达。选用bFGF 基因，通过病毒转染的方法，转染入BMSCs 中[14]。该实验研究发现采用病毒介导的bFGF 基因转染大鼠BMSCs， 可在特定的时间段内持续并大量的分泌出bFGF，通过ELISA 法在12 h 即可检测到bFGF 的表达并随着时间的增加含量逐渐增多，并在60h 累计含量达到最高，可达(19.702±0.074)ng/mL，之后随着时间的延长bFGF 的分泌量随之减少，在72 h 可降低至(11.935±0.203)ng/mL， 但其分泌量均大于其最低有效浓度，即1 ng/mL，结果说明转染在72 h 内均能保持较强的促进BMSCs 增殖的作用， 但是随着时间的延长其分泌量逐渐减少， 故其促增殖作用也将逐渐减弱，应在一定时间内完成相关实验，到达时间后需对细胞重新进行转染，且转染后作用的持续时间需进一步延长。 免疫组化结果证实bFGF 在BMSCs 中高表达且其在胞浆部位表达，说明bFGF 病毒转染入细胞后，能在BMSCs 中得到正确而高效的表达，其中转染的效率最高可达(72.19±8.83)%，说明大鼠BMSCs 转染bFGF 基因的效率较高，具体实施具有一定的可行性。 与人BMSCs 的转基因效率约为(19±1.3)%相比较[15]，转染效率有明显增加，增加了其作为心肌缺血疾病治疗的靶细胞的可操作性。 但与张槐等[16]实验中表达成功率达90% 以上相比较，转染率较低，分析可能是因为转染时的浓度或操作不熟练等问题造成，在后期实验中将进行改进。 同时，大鼠BMSCs 转染bFGF 基因后生长曲线也随之变化，细胞倍增时间由53.6 h 缩短为48.3 h，细胞分裂相增多，推测其可能的原因为物种间不同而产生的差异。 与人BMSCs 倍增时间42.4 h 相比，差异性较小。 并随着bFGF 表达的增加，导致BMSCs 的增殖活性的增加，增殖率可增加至(124.3±1.2)%， 并且可导致其形态的改变， 在bFGF 转染组中， 细胞增殖分裂能力明显强于空病毒组与未转染组，该结果与张槐等人[16]结果一致，证明空病毒组无显著增加BMSCs 的能力， 可能是bFGF 促进了BMSCs 的增殖有关。 与人BMSCs 的96%相比较而言，增殖活性明显提高，推测可能与bFGF 分泌量相关。 因此推测对缺血的心肌组织内植入基因修饰后的BMSCs，有望其在机体内分泌较高含量的bFGF， 从而在特定时间段内发挥促进细胞增殖及分化等生物效应。此外，还可促进BMSCs 的分化成心肌组织的能力，将其作为心肌缺血疾病治疗的靶细胞，在将来有望成为治疗ICM 有效的治疗方法。

综上所述，通过病毒转染的方法，成功将具有多重生物学效应的bFGF 基因转染入大鼠BMSCs。转染后的大鼠BMSCs 可在较长时间内保持较高浓度的bFGF 的分泌。 bFGF 基因转染可促进大鼠BMSCs 的增殖和分化。因此，心肌基因的治疗可将BMSCs 作为靶细胞，将bFGF 转染入其中并保持长时间的分泌水平以促进BMSCs 增殖，在将来有望作为IBM 强有力的治疗手段。