超临界CO2萃取印蒿精油工艺优化及成分分析

丁仡，李源栋，刘秀明，尹开云，邱杰斐，夏建军，杨义，段焰青，*

（1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650202；2.湘潭大学化学学院，湖南湘潭411100；3.昆明香冠科技有限公司，云南昆明650202；4.红云红河烟草（集团）有限责任公司，云南昆明650202）

印蒿（Artemisia palls Wall.）归属于菊科植物蒿属，始于印度南部地区，其具有持久的特征微弱膏香和药香草本植物[1]。印蒿油的主要来源来自印蒿花采用水蒸馏所得，作为食品香料来源，已被多国引进，目前主要用于调配葡萄干、海枣、果脯、桃子、李子等香精[2]。目前国内外关于印蒿精油成分组成报道文献较少[3-6]，这对了解印蒿精油挥发性成分组成和应用有一定的局限性。

植物油提取方法有很多种，有着各自优缺点，其中水蒸气蒸馏法[7]，蒸汽温度过高、易使物质分解且耗能大；溶剂提取法[8]，精油中含有杂质、耗时长、溶剂用量大且难回收；微波辅助提取[9-10]，可能导致挥发油成分发生变化；压榨法[11]会将部分杂质溶于精油中；超临界流体萃取法相比于其他方法可以避免对成分的破坏，避免水解，对活性成分提取更完全，且采用CO2为萃取溶剂，具有无毒，廉价以及来源丰富等特点，广泛用于植物油的提取[12-14]。本研究首次采用超临界流体萃取法提取不同产地印蒿的挥发油，通过探讨不同操作因素对萃取效果影响，并采用气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法结合保留指数对印蒿油进行成分分析，为其开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

印蒿：市场；二氯甲烷、甲醇、正己烷（优级纯）：百灵威科技有限公司；正构烷烃C7～C30：Sigma-Aidrich 公司。

1.1.2 仪器与设备

ZX-FW80 高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；HELIX 超临界流体萃取仪：Applied separations Inc 公司；RE-52A 型旋转蒸发仪：瑞士BUCHI 公司；7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent 公司；ME414S 万分之一电子天平：德国Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 超临界萃取

取30 g 印蒿用粉碎机进行粉碎并过40 目筛选，干燥后将其放入萃取釜。开通CO2，选择萃取温度、萃取压力、萃取时间，收集精油，并通过公式计算出精油的得率。

萃取率/%=（精油质量/印蒿干粉质量）×100

1.2.2 单因素试验设计

设定萃取压力为25 MPa，CO2流量为20 L/h，萃取时间60 min，萃取温度为35、40、45、50、55 ℃条件下对精油得率的影响；设定CO2流量为20 L/h，萃取时间60 min，萃取温度为40 ℃，萃取压力为15、20、25、30、35 MPa 条件下对精油得率的影响；设定萃取压力为25 MPa，萃取时间60 min，萃取温度为40 ℃，CO2流量为10、15、20、25、30 L/h 条件下对精油得率的影响；设定萃取压力为25 MPa，CO2流量为20 L/h，萃取温度为40 ℃，萃取时间40、50、60、70、80 min 条件下对精油得率的影响。进行单因素试验，分析萃取温度、萃取压力、CO2流量、萃取时间对精油得率的影响[15-17]。

1.2.3 印蒿精油成分分析

准确称取印蒿精油0.20 g，用甲醇∶二氯甲烷（体积比为1 ∶4）混合溶液稀释到10 mL，进样前需要将样品用0.45 μm 有机相滤膜过滤，直接进GC/MS 分析。色谱条件：RXi-5sil MS 石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（纯度为99.99 %），流速：1.0 mL/min。升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升温至180 ℃；再以10 ℃/min 的速率升温至230 ℃，保持10 min。进样口温度：250 ℃，进样量：1.0 μL，分流比：20 ∶1，溶剂延迟6 min。质谱条件：离子源：电轰击电离（electron impact ion source，EI）源；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；扫描范围：40 m/z~450 m/z，质谱检索图库：NIST 谱库。

1.2.4 定性方法

移取正构烷烃C7～C30标准品，用正己烷将其稀释成质量分数为5%溶液，按照1.2.3 仪器操作条件进样，求出正构烷烃C7～C30保留时间，为下一步计算印蒿精油中各成分保留指数作准备。

根据Vanden Dool 和Kratz 的线性程序升温的保留指数原理，利用自编软件求得保留指数（kovats index，KI）值：

式中：tx为被分析组分；tn为碳原子数；tn+1为n 和n+1 的正构烷烃流出峰的保留时间，min。

样品印蒿精油经过GC/MS 分析后，利用仪器自带的NIST 质谱库对印蒿精油中化学成分进行自动检索，然后通过云南中烟技术中心开发的保留指数软件求出各成分保留指数，将软件计算的保留指数与精油数据库中保留指数进行比对（可接受误差不超过3%），对其进行定性。

2 结果与分析

2.1 印度印蒿单因素分析

2.1.1 萃取温度

设定萃取压力为25 MPa，CO2流量为20 L/h，萃取时间60 min，萃取温度为35、40、45、50、55 ℃条件下，得出温度对精油得率影响的折线图，见图1。

由图1 可知，温度在超临界流体萃取中，温度升高分子热运动加快，溶剂挥发和扩散系数提高增加了分子间的缔合几率，使得萃取率提高。但另一方面温度过高时，分子间的间距增大，密度减小，不利于传质作用，并可能将易分解的物质分解从而降低萃取得率。

图1 萃取温度对萃取率的影响Fig.1 Influence of extraction temperature on extraction rate

2.1.2 萃取压力

设定CO2流量为20 L/h，萃取时间60 min，萃取温度为40 ℃，萃取压力为15、20、25、30、35 MPa 条件下，得出萃取压力对精油得率影响的折线图见图2。

图2 萃取压力对萃取率的影响Fig.2 Influence of extraction pressure on extraction rate

由图2 可知，萃取压力增大，萃取物的溶解度随之增加，内部分子间的相互作用能急剧增大，使之更加接近油脂内部分子间的作用能。但当压力过大时，CO2密度太大反而会降低传质效率。

2.1.3 CO2流量

设定萃取压力为25 MPa，萃取时间60 min，萃取温度为40 ℃，CO2流量为10、15、20、25、30 L/h 条件下，得出CO2流量对精油得率影响的折线图，见图3。

图3 CO2 流量对萃取率的影响Fig.3 Influence of CO2 flow rate on extraction rate

由图3 可知，当CO2流量增大时，CO2与物料的接触面积增大，提高了溶质密度和传质速度。当流量过大时，物料与CO2接触不够充分，扩散速度不够无法萃取到溶剂中，使得萃取效率降低。

2.1.4 萃取时间

设定萃取压力为25 MPa，CO2流量为20 L/h，萃取温度为40 ℃，萃取时间40、50、60、70、80 min 条件下得出萃取时间对精油得率影响的折线图，见图4。

图4 萃取时间对萃取率的影响Fig.4 Influence of extraction time on extraction rate

由图4 可知，随着时间的增加，CO2与物料接触时间更为充分，萃取效率增加，当达到一个时间点时，物料中的精油大部分被萃取出，往后的效率几乎无变化。

2.2 正交试验结果与分析

结合2.1 在单因素试验基础上，以印蒿精油得率作为评价指标，选取萃取温度（45、50、55 ℃）、萃取压力（25、30、35 MPa）、CO2流量（20、25、30 L/h）、萃取时间（50、60、70 min）进行四因素三水平正交试验，优化印蒿精油提取工艺。正交试验因素水平设计表如表1所示，结果如表2 所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal test factors

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2 可知，考察4 个重要因素指标，对试验的影响大小排序为D＞C＞B＞A，最优组合为A2B2C3D2，既萃取温度为50 ℃、萃取压力30 MPa、CO2流量30 L/h、萃取时间60 min，在此条件下，通过多次试验得出精油平均得率2.26%，得率优于正交试验中的得率，因此最优组合为A2B2C3D2。并采用上述条件提取英国印蒿精油，得率为2.32%。

图5 印度印蒿精油气相色谱/质谱总离子流色谱图Fig.5 GC/MS total ion flow chromatography of India Artemisia palls Wall.oil

2.3 印蒿精油成分分析

印蒿精油中成分经GC/MS 检测所得到总离子流色谱图见图5~图6，其结果采用Nist11 进行检索后结合香精保留指数进行对比对其定性，利用面积归一化法[18]计算得出印蒿精油中各成分相对百分含量，结果见表3。

通过质谱库检索，结合精油数据库辅助定性，提高了天然化合物定性准确性，减少了误判和错判。对检索出的化合物进行定性分析时，发现许多醇类、烷烯类等化合物，若仅用质谱库检索定性会难以判定甚至误判，尤其是同系物和同分异构体的确定[19]。

图6 英国印蒿精油气相色谱/质谱总离子流色谱图Fig.6 GC/MS total ion flow chromatography of English Artemisia palls Wall.oil

表3 印蒿精油成分分析Table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

续表3 印蒿精油成分分析Continue table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

通过质谱库检索和人工图谱解析，结合保留指数比对，从印度印蒿精油中共鉴定出28 个化合物，占印蒿精油成分82.90%，其中烯烃类11 个，酯类5 个，醇类6 个，醚类1 个，酮类2 个，其它化合物3 个，主要成分包括：印蒿酮（36.585%）、大根香叶烯B（11.52%）、肉桂酸乙酯（6.45 %）、印蒿醚（5.46 %）、β-桉叶油醇（1.91%）、β-芹子烯（1.68%）、肉桂酸甲酯（1.30%）等化合物，其中酮类化合物含量最为丰富，占精油成分48.43%；从英国印蒿精油中共鉴定出40 个化合物，占印蒿精油成分83.80%，其中烯烃类16 个，酯类9 个，醇类7 个，醚类1 个，酮类2 个，醛类1 个，酚类1 个，其它化合物3 个，主要成分包括：印蒿酮（45.37%）、大根香叶烯B（11.78%）、肉桂酸乙酯（5.66%）、印蒿醚（4.27%）、β-芹子烯（2.52%）、肉桂酸甲酯（1.45%）、2，6，6-三甲基-1-亚甲基-2-环己烯（1.37%）等化合物，其中酮类化合物含量最为丰富，占精油成分45.45%。从本试验结果可以看到，不同产地印蒿精油成分具有一定的相似性但各组分的相对百分含量具有较大的差异。

3 结论

采用超临界萃取技术对印蒿油进行提取，并以精油得率为指标来优化萃取工艺条件，通过正交试验得出超临界最佳提取工艺条件；利用气相色谱/质谱法，对提取印蒿精油成分进行分析，通过质谱库检索及保留指数验证。从印度和英国印蒿精油中分别鉴定出28、40 种化合物，占总峰面积82.90%和83.80%，主要成分为：印蒿酮、大根香叶烯B、肉桂酸乙酯、印蒿醚等，在定性过程中，使用了保留指数进行验证，提高了化合物定性准确性；本研究结果为印蒿精油开发应用提供了科学依据。