气相色谱串联质谱法测定二白杨受害树皮挥发性物质

焦胜双,许士文,陈 玉,韩 潇,赵大庆,张翌楠*,乔鲁芹*

1.山东农业大学植物保护学院,山东 泰安271018

2.北京农业职业学院,北京102442

3.泰山风景名胜区管理委员会,山东 泰安271018

4.泰安市新泰市林业局,山东 新泰271200

光肩星天牛Anoplophora glabripennis是河西走廊重要造林树种二白杨Populus gansuensis的主要害虫之一[1]，其幼虫危害树干的韧皮部和木质部。有研究表明，植食性昆虫和寄主植物之间普遍流通的化学信息素在两者相互关系中起到至关重要的作用，一方面，昆虫根据植物挥发物定位寄主植物；另一方面，植物自身释放的植物信息素对植食性昆虫具有驱避作用，同时植物受到昆虫危害时会释放化学信息素，吸引昆虫天敌[2,3]，光肩星天牛和二白杨之间同样存在这样的化学通讯。

近年来有关杨树挥发物的测定已有报道，朱敬芳等[4]采用水蒸气蒸馏法提取杨树叶挥发性物质，并结合气相色谱质谱（Gas chromatography-mass spectrometery,GC-MS）分析其化合物28 种，其中近半数为烷烃类；唐进根等[4]利用固相微萃取（Solid phase micro extraction,SPME）和GC-MS 分析黑杨Populus nigra树叶中的挥发性物质20 种；诸葛飘飘[6]利用Tenax 吸附法结合GC-MS 测定了杨树整株的挥发物。目前关于杨树挥发物的研究大多取材于健康的叶片和全株，而对于受到天牛幼虫危害的杨树树皮挥发性物质的研究鲜见报道。以往关于挥发性物质的研究大多采用单一的吸附方法进行前期气味物质收集，且未做方法间比较；另外在分析技术上主要采用GC-MS，该法存在灵敏度低，难以准确定性等问题。因此，建立准确、高效分析二白杨受害树皮挥发性物质的前处理方法和检测分析方法具有重要意义。

为进一步研究二白杨树皮的挥发性物质，本研究采用四种吸附方式（活性炭吸附法、Tenax 吸附法、固相微萃取法和顶空进样法）吸附二白杨受光肩星天牛危害的树皮的挥发性物质，再结合气相色谱串联质谱（Gas chromatography-tandem mass spectrometery,GC-MS/MS）进行定性分析，初步确定二白杨受害树皮的挥发性物质，并以此来比较四种吸附方法的优劣。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜二白杨受光肩星天牛危害树皮，2018 年6 月采集于甘肃省嘉峪关市文殊村。

1.2 仪器与试剂

气相色谱串联质谱仪(GCMS-TQ8030，日本岛津公司)；全自动顶空进样器（HS-20，日本岛津公司）；固相微萃取头（100μm PDMS，美国SUPELCO 公司）；活性炭吸附管（6×120 mm，20-40目，盐城尊科电子仪器有限公司）；Tenax TA 吸附管（6×150 mm，150 mg，盐城尊科电子仪器有限公司）；空气泵（SGK-2LB，北京东方精华苑科技有限公司）；正己烷（色谱纯，天津市凯通化学试剂有限公司）。

1.3 挥发性物质的吸附

用于试验的受光肩星天牛危害的二白杨新鲜树皮，采自同一株树木，均为光肩星天牛的排粪口附近的树皮，去掉粘连的木屑和虫粪，置于密封袋于-40 ℃保存。

1.3.1 活性炭管吸附和Tenax 管吸附 称取50 g 的二白杨受害树皮，剪成约1 cm2小块状，置于250 mL抽滤瓶中，将活化好的吸附管通过导管连接在抽压机和抽滤瓶之间，流速为100 mL/min，吸附时长约2 h（图1）。吸附完成后，用正己烷洗脱，取洗脱液1 μL 进行GC-MS/MS 分析。两种吸附管采样的试验操作步骤相同。

图1 活性炭吸附法和Tenax 吸附法挥发性物质吸附流程图Fig.1 Flow chart of volatile matter adsorption by activated carbon and Tenax adsorption

1.3.2 固相微萃取法 称取50 g 二白杨受害树皮，剪成约1 cm2小块状，置于250 mL 的锥形瓶中，用滤纸将瓶口密封，在室温下放置30 min，待烧杯内部的树皮挥发性物质与顶层空气达到动态平衡之后，将固相微萃取头插入锥形瓶顶层空气中，萃取2 h。吸附完成后，直接进行GC-MS/MS 分析。

1.3.3 顶空进样法 称取2.5 g 二白杨受害树皮，剪成1 cm2小块状，置于顶空进样瓶中，用瓶盖密封，放入顶空进样器，进行GC-MS/MS 分析。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 顶空进样器 恒温炉：80 ℃，样品流路：150 ℃，传输线温度：150 ℃，样品瓶恒温时间：15 min，样品瓶压力：7 kPa，样品瓶加压时间：0.50 min，加压平衡时间：0.10 min，导入时间：0.50 min，导入平衡时间：0.10 min，进样时间：0.50 min。

1.4.2 气相色谱串联质谱条件 活性炭采样-气相色谱串联质谱法、Tenax 采样法-气相色谱串联质谱法和固相微萃取-气相色谱串联质谱法：色谱柱型号为DB-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）毛细管柱；进样口温度：260 ℃；进样方式：分流，分流比：5；进样时间：1.00 min；载气：氦气；柱箱温度：35 ℃保持1.0 min，以5 ℃/min 速率升至160 ℃，再以20 ℃/min 升至220 ℃保持15 min；离子源温度：230 ℃，接口温度：250 ℃，溶剂延迟时间：3.5 min，采集方式：全扫描离子采集方式（Scan），电子能量：70 eV，质量数范围：40 u-350 u。固相微萃取-气相色谱串联质谱法，进样方式：不分流。顶空进样-气相色谱串联质谱法，色谱柱型号为Rtx-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）毛细管柱，进样方式：不分流。

2 结果与分析

在上述吸附条件和色谱质谱条件下，利用气相色谱串联质谱测定二白杨受害树皮中的挥发性物质，挥发性物质种类主要为烷烃类、烯烃类、醇类、酯类、醛类、芳香烃类、酮类、酚类等（见图3），共同的物质有：十四烷、正二十烷、正二十一烷、正三十二烷、正五十四烷、1-十四醇、2-乙基己醇、正己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、2,4-二叔丁基苯酚、磷酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、甲苯、磷酸三乙酯、棕榈酸甲酯、二十七烷醇、硬酯酸甲酯、α-蒎烯、(+)-环苜蓿烯、苯乙酮等。4种吸附方法挥发性物质在数量上和响应值上差异性非常明显（见图2）。

2.1 活性炭-GC-MS/MS 测定二白杨受害树皮中的挥发物

活性炭吸附法结合GC-MS/MS 共检测到29 个色谱峰，二白杨受害树皮的挥发性物质25 种，其中烷烃类11 种，烯烃类2 类，醇类4 种，酯类4 种，酚类2 种，胺类1 类，喹啉1 类。

2.2 Tenax-GC-MS/MS 测定二白杨受害树皮中的挥发物

Tenax 吸附法结合GC-MS/MS 共检测到56 个色谱峰，测定的二白杨受害树皮的挥发性物质有51 种，其中烷烃类9 种、烯烃类5 种、醇类6 种、酯类14 种、醛类6 种、芳香烃类3 种、酮类2类、酚类4 种、酸类1 种、喹啉类1 种。

2.3 SPME-GC-MS/MS 测定二白杨受害树皮中的挥发物

SPME 法结合GC-MS/MS 共检测到48 个色谱峰，测定的二白杨受害树皮的挥发性物质有36 种，其中烷烃类8 种、烯烃类1 种、醇类6 种、酯类5 种、醛类11 种、酮类2 种、酚类1 种、酸酐1 种，吗啡类1 种。

2.4 HS-GC-MS/MS 测定二白杨受害树皮中的挥发物

顶空进样（Headspace sampling，HS）结合GC-MS/MS 测定的二白杨受害树皮的挥发性物质共检测到39 个色谱峰，测定的二白杨受害树皮的挥发性物质有37 种，烯烃类20 种、醇类2 种、酯类1 种、醛类8 种、芳香烃4 种、酮类2 种。

图2 气相色谱串联质谱法测定的挥发物的色谱图Fig.2 Chromatogram of volatile compounds determined by gas chromatography tandem mass spectrometry

图3 挥发物种类对比Fig.3 Comparison of volatile species

3 讨论

3.1 四种挥发性物质前处理方法对比

通过对挥发物种类和色谱响应面积等试验结果进行综合比较，可分析得出常温环境下四种前处理方法具有如下特点：

活性炭吸附法经GC-MS/MS 定性分析测定出的物质更容易测定出烷类、醇类、酯类、酚类、烷类等种类的挥发物，但整体上挥发物种类较少，响应值也低，同其他三种采集方法相比，不适合用来吸附树皮的挥发性物质（见图2）。

Tenax 吸附法采集的挥发物比较全面，采集范围广，吸附效果好，吸附量也更大，是四种吸附方法中检测到物质种类最多和最全面的一种（见图2 和表1）。在GC-MS/MS 分析时，因色谱柱超载，Tenax 吸附法和活性炭的进样分流比设定为5:1，SPME 法和HS 法在分流比5:1 的条件下响应值过小，所以进样分流比设定为不分流，在这样条件下，Tenax 吸附法的响应面积远大于另外三种方法。Tenax 管方便携带且能重复利用，其填充物聚2,6-二苯基对苯醚对常温环境下的低浓度物质也具有良好的富集效果[7]，是我国室内空气质量标准规定的总挥发性有机物吸附剂[8]。但Tenax 管在老化、吸附以及解析过程中，耗时较大。

同其他三种方式相比，SPME 法吸附更多的烷烃类、醇类、醛类物质，其中正己醛、2-己烯醇和正己醇等醛类、醇类绿叶挥发物（Green leaf volatiles,GLVs）在SPME-GC-MS/MS 结果中大量发现。SPME 法耗时短，且能重复利用，但对萃取头的材料选择以及对萃取条件等要求较高，本文综合以往报道[9-11]，采用了100 μm 的PDMS 纤维头在常温（25 ℃）环境下萃取2 h。GC-MS/MS 定性结果显示，SPME 方法测定出的烯烃类物质较少，与文献的测定结果一致[5]，这可能与萃取头的材料有关。

HS 法对烯烃类化合物具有良好的采集效果，是采集烯类物质最合适的方法。本试验综合以往报道[12,13]和预试验结果设定了HS 试验仪器参数。GC-MS/MS 定性结果显示，同其他三种方式相比，HS 法测定出更多类型的烯烃类物质，如(+)-环苜蓿烯、R-(+)-柠檬烯、莰烯、丁香烯、荜澄茄油烯、杜松烯、反-菖蒲烯等烯类物质（见表1）。HS 法操作简易，是耗时最短的吸附方法，但也是四种前处理方法中响应面积最小的一种。

本研究利用气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）对4 种吸附方法采集到的挥发性物质进行了定性分析。相对于气相色谱质谱（GC-MS），气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）的质谱分辨率和灵敏度更高，定性出的化合物更加可靠。

不同的吸附方法进行气相色谱质谱联用定性分析得到的结果表明，不同的吸附方法对不同物质具有不同程度的吸附能力。活性炭不适合用于吸附二白杨受害树皮挥发性物质，Tenax 吸附、SPME和HS 三种前处理方法的结果相互补充，不能互相代替，因此可以针对不同的试验需求，选择合适的吸附方法进行挥发性物质种类的测定。SPME 法能吸附更多种类的醇类、醛类绿叶挥发物，所以若研究对象为绿叶挥发物，SPME 法是最合适的吸附方式。根据其他学者的研究进展[14-16]，在研究光肩星天牛对二白杨何种挥发性物质产生趋向性的试验中，烯类、醛类物质（如3-蒈烯、R-(+)-柠檬烯和壬醛等）可能在光肩星天牛取食二白杨或天敌昆虫定位天牛过程中发挥作用，所以Tenax 吸附法和顶空进样法这两种采集方法更加适合。

3.2 四种挥发性物质前处理方法结果差异原因

4 种前处理方法所得到的结果存在差异，这主要是由吸附方法自身特点造成的。活性炭和Tenax吸附管的填充材料和固相微萃取纤维头表面涂料的固有属性的不同，对于相同的物质，具有不同的吸附效果。在自动进样的过程中，加温加压的步骤影响二白杨树皮中挥发物质的挥发，进而影响定性结果，但相对其他方法，顶空进样测得的化合物的响应值较低，这与顶空进样瓶容量小有关，且相对于活性炭、Tenax 填充物和固相微萃取纤维头，顶空进样没有对化合物的捕获和浓缩富集能力。

4 结论

本研究基于灵敏度高，定性更加准确的GC/MS/MS 分析二白杨受害树皮中的挥发性物质，检测出的物质主要有烷烃类、烯烃类、醇类、酯类、醛类、芳香烃类、酮类、酚类等，综合比较了活性炭吸附法、Tenax 吸附法、固相微萃取法和顶空进样法4 种前处理方法，从结果看，Tenax 吸附-气相色谱串联质谱法和顶空进样-气相色谱串联质谱法是测定二白杨受害树皮挥发性物质较适合的方法。