辣木多酚抑制结肠癌细胞增殖及促进细胞凋亡的作用①

杨 敏 李文云 马 莉 解 静 李凌飞 田 洋1,③

(1 云南农业大学食品科学技术学院 云南昆明650201;2 国家辣木加工技术研发中心 云南昆明650201)

结肠癌是发生在结肠部位的消化道常见恶性肿瘤，也是世界四大肿瘤之一［1]。根据世界流行病学调查报告，结肠癌发病率最高的地方是北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地［2]。近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，中国结肠癌的发病率逐年上升，流行病学研究表明，除了遗传因素外，结肠癌的病因与饮食密切相关。研究表明，食用红肉与结直肠癌的发生呈正相关，食用鱼、蔬菜和水果与结直肠癌的发生呈负相关［3]。目前结肠癌的主要治疗方法是手术和化疗，手术创伤较大且有复发的风险，化疗药物副作用较大，可抑制人体免疫功能，对人体功能造成损害。近年来，开发天然的肿瘤预防、干扰物质尤其受到重视，其中最有希望的是一类来源于植物活性成分中的多酚类物质［4]，植物多酚不仅具有抗炎杀菌的作用，还与癌症低发有密切联系。多酚抗癌作用机理主要与其抗氧化、抗突变、调节免疫、抑制致癌物导致的癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡、抑制致癌基因表达、调控信号传导及影响机体酶活性等有关［5-8]。

辣木（Moringa oleiferaLam）为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，耐旱能力强，广泛种植于亚洲、非洲的热带及亚热带地区［9]。辣木又称为“奇迹之树”，是一种含有丰富营养成分且极具药用价值的植物，可作为增强体力、降糖降脂、抑制病菌、抗癌防癌等天然的植物来源食品［10]。辣木叶是辣木中富含多酚、黄酮、蛋白质及微量元素的部位。中国卫生部门于2012年11月12日在《中华人民共和国卫生部2012年第十九号公告》中将辣木叶批准为新资源食品［11]。辣木叶含有大量抗氧化活性物质，Siddhuraju 等［12]发现，辣木叶的醇提物抗氧化活性达66.8%，具有良好的自由基清除能力。另外，辣木叶中的抗氧化组分也可以抑制自由基引起的氧化低密度脂蛋白的产生，达到降血脂和防止动脉粥样硬化的作用。同时辣木叶还能抑制人体肿瘤细胞增殖，例如Tiloke 等［13]发现，辣木叶提取物可以抑制肺癌细胞A549 的生长。Berkovich 等［14]发现，辣木叶提取物通过干预NF-κB信号通路抑制了胰腺癌细胞的生长，这主要是由于辣木叶提取物中富含多酚类化合物。

辣木叶多酚是辣木叶中所含多元酚类的总称。研究发现，辣木叶多酚的体外抗氧化活性是同等质量浓度VC 的75%以上［15]，除具有较强的抗氧化活性外，辣木叶多酚还有抑菌、消炎、抗癌、抗菌、抗病毒、保护肝脏、降血压等多种医疗价值和生物功效［16-18]。Singh 等［19]通过高效液相色谱分析发现，辣木叶中含有没食子酸、绿原酸、鞣花酸、阿魏酸、山奈酚、槲皮素、香兰素等酚类单体成分。Kashiwada 等［20]从5 kg 辣木叶中分离出了10 种活性化合物成分，其中含有异槲皮苷（3.5 g）、槲皮素2 种衍生物（1.16 g）、山奈酚（364 mg）、绿原酸（120 mg）等，这些酚类单体均具有抑制肿瘤、抗炎消毒等作用。

虽然辣木提取物具有多种功效，但以往的研究主要涉及辣木及其提取物的抗氧化活性或功能食品开发。关于辣木叶醇提物中多酚类物质及其含有的主要酚类单体对人结肠癌细胞的抑制作用尚未见报道。因此本研究通过MTT 细胞活率测定、细胞克隆形成及划痕实验、细胞凋亡实验及检测凋亡蛋白的表达，探究辣木多酚提取物及其主要酚类单体化合物在结肠癌HCT116 细胞中的抗癌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

辣木叶粉购于云南天佑科技开发有限公司；人结肠癌细胞系HCT116、人结肠正常上皮细胞系NCM460 均购于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基四唑溴化物噻唑蓝（MTT）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自北京索莱宝科技有限公司；F-12 高糖培养基、DMEM 高糖培养基均购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Thermo Scientific 公司；槲皮素、异槲皮素、芦丁、山奈酚、绿原酸、金丝桃苷均购自美国Sigma-Aldrich 公司，纯度≥99%；Annexin V/PIFITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；抗体Bax、Bcl-2均购自美国Cell Signaling Technology公司；抗体Tublin购于英国Abcam公司。

1.1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD 型超净工作台（安徽安泰空气技术有限公司）；二氧化碳培养箱（苏州贝茵医疗器械有限公司）；Countess 细胞计数器（美国Thermo Scientific 公司）；XDS-800C 型倒置电子显微镜（日本奥林巴斯公司）；全波长酶标仪（BioTek Instruments 公司）；SC3616 型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；XMTD203 型恒温水浴锅（中国江苏太仓华利达实验设备有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；电泳槽电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 辣木叶多酚提取

参考赵谋明等［21]、沈慧等［22]的方法，采用超声辅助乙醇提取法从辣木叶中提取多酚。先将辣木叶粉碎，过40 目筛；称取3 份辣木叶干粉，每份30 g，按照1∶10 的料液比体系分别加入体积分数为20%、50%、80 %的乙醇溶液，在温度60℃，超声功率800 W 的条件下提取60 min，6000 r/min离心8 min，弃去沉淀收集上清液；将残渣按照上述方法反复提取2次，合并所有上清液后在40℃条件下旋转蒸发浓缩20 min；采取冷冻干燥的方法获得辣木叶多酚粉末，样品放置于-80 ℃保存。

1.2.2 辣木叶多酚浓度的测定

参考赵谋明［21]、林诗洋［23]等方法，采用福林—酚法测定辣木叶中多酚含量，以没食子酸为标准品，设定标准溶液质量浓度为0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、500 mg/mL；吸取1 mL 辣木叶多酚粗提液，加入0.5 mL 福林酚试剂，充分摇匀后加入质量分数为20%的饱和碳酸钠溶液1.5 mL；之后补加7 mL 去离子水定容至10 mL，室温下避光孵育1 h，以4℃12000 g 离心8 min，于760 nm 波长处测量吸光度。获得的标准曲线方程为：y＝2.1438x＋0.1308（R2＝0.9938）。

1.2.3 细胞培养

将HCT116 细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的F-12 培养液中，将NCM460细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链酶素混合液的DMEM 培养液中，置于37℃，含5% CO2培养箱中培养。

1.2.4 细胞活力测定

取对数生长期的HCT116 细胞和NCM460 细胞，接种于96 孔板中培养，24 h 后弃去培养液，分别加入不同浓度的辣木多酚（50、100、200、400 μg/mL）处理细胞。此外选用辣木多酚中6 种主要单体成分芦丁、山奈酚、绿原酸、槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷分别处理细胞，每种药物浓度均为（5、10、20、40、80 μg/mL），同时以不添加辣木多酚组别为空白对照组；置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，分别孵育24、48、72 h 后；各孔加入10 μL MTT溶液，继续孵育4 h，在酶联免疫检测仪上490 nm 波长处测定各孔吸光度（A 值），按照以下公式计算细胞增殖抑制率。

1.2.5 细胞克隆形成能力测定

将HCT116 细胞接种于6 孔板中，用80%乙醇提取的辣木多酚处理细胞48 h 后，换含有胎牛血清的培养基继续培养细胞；至空白对照组细胞生长至80%，用预冷的PBS 洗2 次，4%多聚甲醇固定液固定10 min；弃去甲醇固定液，加入0.1%结晶紫染色30 min，用PBS 清洗后风干并拍照，计数克隆并按照下式计算细胞克隆形成率。

1.2.6 细胞划痕生长能力测定

将HCT116 细胞接种于6 孔板，待孔中细胞密度长至80%时，用200 μL 塑料移液管头垂直于孔板，自上而下制造划痕，弃去培养基，加入辣木多酚处理，拍照后继续培养48 h；后用PBS 溶液冲洗2 次，加入不含胎牛血清的培养液，拍照记录，使用Image J Pro软件计算各组划痕部位细胞迁移面积。

1.2.7 细胞凋亡检测

将HCT116 细胞接种于培养皿中，加入80%乙醇提取的辣木多酚继续培养；用不含EDTA 的胰酶消化离心收集细胞，冰PBS 清洗3 遍，收集细胞，以1200 r/min 离心3 min；弃去上清液，按照AnnexinV-FITC 凋亡试剂盒说明书进行染色，加100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞后，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光，室温反应15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，以200 目滤布过滤后将样品置于冰上，采用流式细胞仪和Flow Jo 9.0软件检测并分析细胞凋亡情况。

1.2.8 细胞蛋白表达量检测

为进一步探究辣木多酚对结肠癌细胞凋亡的分子机制，采用Western blot 技术对HCT116 细胞内2 个主要凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2 进行检测。将细胞按每皿9×105个接种于培养皿中培养，加入辣木多酚，培养48 h 后用PBS 清洗3 遍，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，于4℃下12000 r/min 离心10 min后取上清液；采用BCA法测定细胞蛋白浓度，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电泳结束后在冰水浴条件下将分离胶上蛋白转移至PVDF膜上；采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h 后孵育抗体4℃过夜，经TBST 清洗3 遍后孵育兔抗1 h，加入ECL 试剂发光成像，拍照，并用Image J 软件进行灰度值分析。

1.2.9 数据统计与分析

测量数据用（均数±标准差）表示，采用Graphpad Prism 5.0 软件、SPSS 软件进行实验数据分析，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度乙醇提取的辣木多酚对结肠癌细胞增殖的影响

如图1-A 所示，不同浓度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木多酚对人结肠癌细胞HCT116 增殖均有抑制作用，其中80%乙醇提取的辣木多酚对HCT116 细胞抑制效果最好，且随着作用时间延长，处理浓度增加，抑制作用越明显。当剂量为400 μg/mL 时，处理细胞48 h 后抑制率达到96.4%以上，抑制作用呈剂量依赖性。各浓度组细胞抑制率与对照组比较具有统计学差异。同时图1-B显示，不同浓度（20%、50%、80%）乙醇提取的辣木叶多酚对人结肠正常细胞NCM460几乎无抑制作用，不影响其正常生长。

2.2 辣木多酚单体成分对结肠癌细胞增殖的影响

为明确辣木多酚提取物中单体成分对HCT116细胞增殖的抑制作用，选择辣木叶中含量较高的6种酚类单体山奈酚、槲皮素、异槲皮素、绿原酸、芦丁和金丝桃苷为原料，分别将这6 种单体以5、10、20、40、80 μg/mL 的浓度处理HCT116 细胞，孵育24、48、72 h后进行MTT实验，测定细胞存活率，结果见图2。所有单体处理细胞24～48 h 后，低浓度剂量下多种单体对结肠癌HCT116 细胞无显著抑制作用，而高浓度40和80 μg/mL 剂量下对HCT116 细胞有一定抑制作用，但抑制率不高。80 μg/mL 的山奈酚、槲皮素、异槲皮素、绿原酸、芦丁、金丝桃苷分别处理HCT116 细胞72 h，其抑制率 分 别 为28.34%、 48.12%、 45.03%、 43.27%、42.56%和44.85%。与辣木多酚混合物相比，酚类单体对结肠癌细胞的抑制效果均没有辣木多酚混合物好，推测辣木多酚对HCT116 细胞的抑制作用可能是通过多种单体协同作用。

2.3 辣木多酚对结肠癌细胞HCT116 生长迁移能力的影响

经结晶紫染色固定后，辣木多酚处理HCT116细胞的克隆形成率如图3-A、3-B 所示。与对照组相比，50、100、200 μg/mL 辣木多酚处理组的克隆形成率显著降低，且随着药物浓度的增加，细胞克隆形成数呈降低趋势。为进一步观察辣木多酚处理后细胞的迁移能力，采用划痕实验观察并测量了细胞的迁移距离。结果表明，与对照组相比，辣木多酚处理组细胞的划痕宽度明显大于对照组，24 h后对照组细胞已出现愈合迹象，而辣木多酚处理组划痕没有愈合（图3-C、3-D）。表明80%乙醇提取的辣木多酚阻碍结肠癌HCT116细胞的迁移能力具剂量依懒性。

2.4 辣木多酚对HCT116细胞凋亡的影响

凋亡细胞的显著特征是细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，并能够特异性结合Annexin V染料，PI 是一种核酸染料，可以透过凋亡细胞和晚期细胞的细胞膜进行特异性结合。本研究采用Annexin V/PI 双染法检测80%乙醇提取的辣木多酚处理人结肠癌HCT116细胞48 h后的凋亡诱导效应。结果如图4-A 所示。Annexin V 阳性凋亡细胞随多酚混合物浓度的增加而增加。如图4-B所示，与对照组相比，50、100、200 μg/mL 多酚处理后细胞凋亡率（早期凋亡细胞＋晚期凋亡细胞）分别为19.2%、23.57%、30.62%，表明80%乙醇提取的辣木多酚可以促进结肠癌细胞凋亡。此外，通过Western blot技术从分子机制方面探究了凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax的表达情况（图4-C、4-D、4-E），分别用50、100、200 μg/mL的80%乙醇提取的辣木多酚处理细胞48 h 后，HCT116 细胞中促凋亡蛋白Bax的表达有增加趋势，而细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平降低，表明辣木多酚诱导的细胞凋亡可能是由内在凋亡途径所驱动的。

3 讨论

本研究以辣木叶为原料，评估了辣木多酚及其中主要酚类单体在结肠癌细胞中的抗肿瘤作用，采用3 种不同浓度（20%、50%、80%）乙醇溶液提取的辣木多酚作用于人结肠癌HCT116细胞后发现，80%醇提辣木多酚的抑制作用优于20%和50%醇提多酚。当剂量达到400 μg/mL时，HCT116细胞的抑制率达96.4%以上。Lin 等［24]、Yi 等［25]研究蓝莓多酚和苹果多酚的抗结肠癌作用时发现，当苹果多酚和蓝莓多酚的浓度分别达到2和10 mg/mL 时，才能抑制结肠癌细胞的生长［24-25]。因此，与其他植物多酚相比，辣木叶多酚似乎发挥了更多抗结肠癌的作用。为了明确辣木叶多酚中单体成分对结肠癌增殖的抑制效果，本研究选用山奈酚、槲皮素、绿原酸、异槲皮素、芦丁、金丝桃素6种辣木多酚单体作用于HCT116 细胞，结果表明，多酚单体对HCT116 细胞增殖的抑制作用远不如多酚提取物，表明多酚类单体主要通过协同作用来发挥抗结肠癌作用。也有研究表明，大多数植物提取物不是单一成分作用，而是多种物质的协同作用和凝集作用［26-27]。

细胞凋亡是维持细胞增殖和死亡动态平衡中非常重要的因素，细胞凋亡功能的丧失或受抑制是肿瘤发生的一个非常重要的因素［28]。在肿瘤治疗中肿瘤细胞是否凋亡是判断肿瘤治疗成功与否的关键因素之一。因此，抑制癌细胞的增殖和迁移并提高细胞凋亡的速率是药物具有抗癌作用的前提［29-30]。本研究发现，辣木多酚不仅能明显抑制HCT116 细胞的克隆形成和细胞迁移，而且能够使HCT116 细胞凋亡率增加；蛋白免疫技术的结果也表明，辣木多酚处理HCT116 细胞后，主要调控凋亡的2 种蛋白（Bax和Bcl-2）的表达发生了变化，其中，促进凋亡的Bax 蛋白表达有增加趋势，而抗凋亡的Bcl-2 蛋白表达显著降低，这2 种蛋白表达的改变导致HCT116 细胞凋亡加速，表明辣木多酚抑制结肠癌HCT116 细胞增殖的潜在机制可能与促进细胞凋亡有关。