抗根肿病大白菜近等基因系的构建

张红　黄志银　李梅　范伟强　温娟娟　王超楠

摘要  为培育具有抗根肿病基因的青麻叶大白菜，丰富天津地方种质资源，以优良的青麻叶自交系H227作为轮回亲本，12G57自交系作为抗根肿病基因的供体亲本，利用分子标记辅助选择技术，在BC3F2世代即选育出4株轮回亲本基因组含量为100%的纯合抗性单株，快速高效地构建了抗根肿的青麻叶近等基因系。从抗病性、农艺性状等方面分别对所获得4个近等基因系进行评价，结果发现表型均达抗病，主要农艺性状也均与轮回亲本H227无显著差异，表明今后不仅可用作青麻叶抗病育种实践的材料，而且可作为根肿病抗病基因定位的最佳材料。

关键词  青麻叶大白菜;抗根肿病基因;近等基因系;分子标记辅助选择

中图分类号  S634.1    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0128-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.039

Construction of Near-isogenic Lines of Chinese Cabbage with Clubroot Resistance

ZHANG Hong，HUANG Zhi-yin，LI Mei et al  （Tianjin Kerun Vegetable Research Institute， National Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetic and Breeding Enterprises， Tianjin 300381）

Abstract  In order to cultivate abutilon leaves Chinese cabbage with clubroot resistance gene and enrich local germplasm resources in Tianjin， taking excellent inbred lines H227 abutilon leave as recurrent parents， 12G57 inbred lines as the donor parents of clubroot resistance gene，four homozygous resistant plants with 100% genome content of recurrent parents were bred in BC3F2 generation， and the near-isogenic lines with resistance to clubroot disease were constructed rapidly and efficiently by using marker-assisted selection technology.From the aspects of disease resistance， agronomic characters of four near-isogenic lines，all the phenotypes were disease-resistant， and the main agronomic traits were not significantly different from the recurrent parent H227， indicating that it could not only be used as the material for disease resistance breeding of green leaves in the future， but also as the best material for the location of clubroot resistance gene.

Key words  Abutilon leave;Clubroot resistance gene;Near-isogenic lines;Marker-assisted selection

基金項目  青年科研人员创新研究与实验项目（2018013，2018003）;天津市现代农业产业技术体系创新团队建设专项计划（ITTVRS2017003）。

作者简介  张红（1990—），女，天津人，研究实习员，硕士，从事大白菜分子育种工作。*通信作者，副研究员，硕士，从事十字花科蔬菜育种研究。

收稿日期  2019-09-03

青麻叶大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是天津地区特有的一个地方性种质资源，由于栽培效益好，复种指数高，市场范围逐渐扩大，发展前景可观。但其本身缺乏抗根肿病基因，栽培中容易受到根肿病的侵害，加之近年来根肿病的迅速蔓延，青麻叶大白菜主要栽培地区均受到损害，在根肿病的高发地区，其品种品质和产量均受到极大损害，严重的甚至会导致其全面退出市场。尽快培育出兼具抗病基因和青麻叶优良性状的大白菜品种迫在眉睫。

在育种中，常采取回交转育的方法将目标性状转移到优良品种中去。经过长期、大量的回交及田间选择，选育出遗传背景相近，仅目标性状存在差异的一组品系，即构建近等基因系。它的优势在于不仅可以应用于育种实践，而且广泛应用于品种改良、基因多效性分析、目标基因分离、基因精细定位和克隆等研究[1-6]，但这是一项长期而艰巨的工作，不仅工作量大，耗时、耗力而且往往依靠经验选择，容易造成筛选误差。分子标记辅助（MAS）技术能够在植物发育的任何时期利用种子或者叶片快速开展试验[7]，简化了筛选过程，开拓了一条更为高效的途径，它也从分子水平上确保了筛选的真实性、准确性。

近年来，国内外学者逐渐应用分子标记辅助育种技术在水稻、玉米、白菜等作物中开展研究[8-15]，但针对地方性种质资源青麻叶大白菜的抗根肿病育种研究尚存在空白。该研究旨在利用分子标记技术辅助选育出兼具抗病基因和青麻叶性状的大白菜近等基因系，建立一套快速高效的近等基因系构建体系，不仅可以丰富天津青麻叶大白菜的种质资源，而且对提升该市大白菜分子育种水平和快速选育抗病品种具有重要的战略意义。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试材来源。‘12G57含有抗根肿病基因CRb的大白菜[16]，作为供体亲本;‘H227青麻叶大白菜，缺乏根肿病抗性基因，商品性状优良，作为轮回亲本。2组材料均由天津科润蔬菜研究所大白菜课题组提供。

1.1.2  菌株来源。供试菌株自湖北长阳贺家坪的大白菜发病肿根中采集，该菌经Williams方法鉴定为致病性强的4号生理小种[17-18]，菌株取回后洗净干燥处理，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.1.3  分子标记引物来源。前期试验开发了2个与‘12G57中抗根肿病基因CRb连锁的分子标记 Bra0235-2和Bra19317，经验证在抗感双亲‘12G57和‘H227间具有多态性，可用于各世代的前景选择。在分布于大白菜基因组的680个SSR标记中[19-20]，选择均匀分布于 10条染色体的140个分子标记，通过父母本间的筛选，获得稳定的多态性标记20个可用于各世代的背景选择，上述引物均由华大基因公司合成。

1.2  方法

田间试验主要在天津科润蔬菜研究所武清基地日光温室及宝坻露地开展。分子试验在天津科润蔬菜研究所分子实验室开展。

1.2.1  各世代的前景选择。

试验前期对田间定植的36株BC1F1群体进行2个连锁标记Bra019235-2和Bra019317的筛选，选出兼具2个标记抗病带型的单株与H227轮回亲本回交，得到下一代回交群体，依此多次回交。

分子标记筛选试验中大白菜的DNA采用改良后的碱裂解法提取[21]，并利用1%的琼脂糖凝胶电泳（电泳缓冲液为1×TAE）对DNA的提取质量进行检测，GelRed染色，在凝胶成像仪上成像、观察。以10 μL的PCR反应体系进行扩增，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。

1.2.2  各世代的背景选择。

选择均匀分布于10条染色体的140个标记，通过父母本间的筛选，得到20个稳定的多态性标记用于各世代的‘H227基因组背景选择。在根肿病连锁标记前景选择的前提下，从每个世代的抗性杂合单株中选择‘H227基因组含量高的单株用于回交或自交，直至筛选出抗性基因纯合且基因组与‘H227完全相同的个体，即为抗根肿病的‘H227近等基因系。

轮回亲本基因组含量= SSR 标记位点纯合数/SSR 标记总数×100%

轮回亲本基因组含量期望值=（1-1/2r+1）× 100%，式中 r 为回交次数。

1.2.3  根肿病人工接种鉴定。

在天津科润蔬菜研究所武清基地采用密封菌土法进行根肿病人工接种鉴定，取自交系‘H227和‘12G57及近等基因系GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13的种子各32穴，每穴留苗1株 。苗盘置于温室通风阴凉处，25 ℃条件下生长，避免阳光长时间直晒，苗盘下保持1 cm水层，接种30～ 40 d开始调查病情指数。

根肿病病情调查方法及分级标准参考王彤彤等[19]，PIAO等[22]的描述，分为0～7级，即0级，主根未发生病害，主、侧根正常，无根瘤;1级，主根未发生病害，侧根有个别小根瘤;3级，主根出现病害症状但肿大不明显，侧根出现较多根瘤;5级，主根根瘤明显，主根根瘤直径为茎基的 2～3 倍，侧根出现许多大的根瘤;7级，主根异常肿大，主根根瘤直径为茎基的3倍以上，侧根根瘤多而大。

病情指数=[Σ（各级病株数×相应级别）/（调查总株数×发病最高级别代表值）]×100% ，病情指数<10为抗病（R），病情指數≥10为感病（S）。

数据采用SPSS17.0软件Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

1.2.4  近等基因系的农艺性状鉴定。

在宝坻试验基地对近等基因系和轮回亲本H227进行表型鉴定，采用随机区组试验设计，重复3次，每次重复36株。收获期记录调查球重、中心柱高、株高、株幅、心叶色、外叶色、叶皱、茸毛、抗病性等农艺性状，并利用DPS软件分析差异显著性。

2  结果与分析

2.1  各世代的前景选择和全基因背景选择

2.1.1  BC1F1世代。在BC1F1 代36 株个体中，仅进行前景选择，利用分子标记Bra0235-2和Bra19317筛选出均表现杂合抗病带型的 17 株个体（图1），结合田间表型选择结果，随机选择5株个体与轮回亲本进行回交，次年获得 5个株系的BC2F1代种子。

2.1.2  BC2F1世代。

在构建BC2F1世代群体时，需要考虑群体数量的大小与选择效率间的关系，过小无法筛选到目标性状单株，过大则加重筛选的工作量。Frisch等[23]就此研究发现在各世代群体中至少15～20株才能筛选出1个目标个体。张腾等[10]则认为在白菜基因组中回交群体筛选7株即可获得2个目标个体。该研究为降低工作量及保证单株中选概率，自BC2F1代开始每个株系的群体数量设定为18株。

来自5个株系的BC2F1群体（GZ1～GZ5）共90个单株，在其中筛选出杂合抗病单株42株，纯合感病单株48株。经过对42株杂合抗病单株进行分子标记背景选择，获得17株轮回亲本基因组含量高于87.5%的单株，分别与轮回亲本回交构建BC3F1代。

2.1.3  BC3F1世代。

BC3F1群体（GZ1～GZ17）中共有306个单株，17株田间早期死亡，对289株样本进行前景选择筛选出杂合抗病单株143株，纯合感病单株146株，符合1∶1分离比，再次验证了两标记的适用性。背景选择到轮回亲本基因组含量高的单株10株，其中基因组含量为95%的6株，90%的4株。中选单株分别与轮回亲本回交构建BC4F1群体，并选择基因组含量为95%的6株分别自交构建BC3F2代。

2.1.4  BC4F1世代和BC3F2世代。

对回交群体BC4F1进行前景选择获得杂合单株90株，结合田间表型选育，每个株系选择5株进行背景选择，共筛选出9株‘H227基因组含量为100%的单株。对BC3F2群体中前景选择获得纯合抗性单株19株（表1），进一步进行背景选择，得到4株‘H227基因组含量为100%的单株（表2）。

2.2  根肿病抗性鉴定

课题组前期试验验证了12G57材料中抗病性受显性单基因控制，遵循孟德尔遗传定律[24]。对高抗病亲本材料12G57、高感病亲本材料H227以及近等基因系GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13接种鉴定，35 d后，依据病情分级标准进行根肿病抗性鉴定统计（表3），结果发现，12G57均表现为抗病、H227均表现为感病、4个近等基因系均表现为抗病，苗期接种鉴定结果与分子筛选结果一致。

2.3  近等基因系农艺性状鉴定

以青麻叶优良性状大白菜H227作为对照，对GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13这4个近等基因系进行农艺性状调查，结果发现，在 0.01水平下4个近等基因系与H227在球高、球重、中心柱高、株高、株幅等数量性状中差异不显著（表4），在株型、心叶色、外叶色、叶皱、茸毛、抗病性等质量性状中与轮回亲本一致（表4、图2），说明通过分子辅助育种不仅从分子水平上获得了轮回基因组100%的近等基因系，数量、质量等主要农艺性状也已与轮回亲本一致。

3  结论与讨论

青麻叶大白菜是天津地区重要的优势地方种质资源，其经济性状优良，堪称天津人民冬季的“当家菜”。但近年云南、河北、山东、重庆、辽宁等多个青麻叶的主栽区根肿病频发，已严重危害青麻叶大白菜的生产，对居民的“菜篮子”造成了一定影响，因此开展抗病育种研究迫在眉睫。但我国开展抗根肿病研究相对较迟，针对具体地方性种质资源的研究更存在一定的空白。该试验以青麻叶优良自交系‘H227为轮回亲本，利用分子标记辅助选择技术快速高效地在BC3F2群体中筛选出轮回亲本基因组含量为100%的4株纯合抗性单株，构建一批抗根肿的青麻叶大白菜近等基因系，并分别从抗病性、主要农艺性状等方面进行了评价及鉴定。不仅极大地丰富了天津青麻叶大白菜的种质资源，也为今后进行品种改良及多抗基因聚合研究打下了基础。

盛浩闻等[25]认為在传统的抗病育种中仅依靠田间表型性状选择进行单基因转育至少需要回交6代以上才能选育出高质量的近等基因系，且大量材料依靠人工选择极容易受到主观因素的影响而造成误差。此外当表型性状非质量性状时，与表型相关的基因不一定完全通过表型体现，此时也将降低回交转育的效率。该试验在田间表型选择的基础上辅以分子标记选择技术，将传统育种技术与现代育种技术紧密融合，保证了选择结果的准确性，提高了选择效率，仅经历3代筛选就获得了充分恢复轮回亲本基因组含量的个体，进一步验证了Tanksley等[7]的结论。

抗病鉴定过程中所用菌株来源于湖北长阳贺家坪，研究表明[17-18]该菌为强致病性的4号生理小种，理论上构建的抗病品种抗性强，但目前不同地区根肿菌的生理小种存在不同且复杂，国际已公布报道的大白菜根肿病抗性的基因也约有9个，因此单一抗病基因只对部分生理小种产生抗性，抗性不全面，且长期种植单一抗性基因的品种易降低抗病性。今后在该试验基础上，继续依靠分子标记技术将多个近等基因系的优良基因聚合，培育具有复合抗性的大白菜品种意义重大。

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