发酵饲料在克氏原螯虾喂养中的应用研究

马仁胜　高常年　鲍俊杰　王永杰

摘要  [目的]優化植物源蛋白发酵饲料的生产工艺，探讨发酵饲料替代传统膨化饲料饲养克氏原螯虾的可能性。[方法]以小肽含量为指标，对枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌3个菌种的混合发酵工艺条件进行优化，并用该工艺条件生产的发酵饲料来饲养克氏原螯虾。[结果]枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌3个菌种混菌发酵最佳工艺条件为接种量15%、固液比2∶1（g∶mL）、发酵时间96 h、温度32 ℃，且接种枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌的比例为 12∶3∶2;原料经过混合菌发酵后，小肽含量提高了约10倍，粗纤维含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量变化不明显。采用发酵饲料喂养的克氏原螯虾，在生长初期增重速率明显高于投喂膨化饲料的，发酵饲料组虾田水体pH和溶氧都略低于膨化饲料组，氨氮对比差异不明显。[结论]发酵饲料更易于克氏原螯虾生长初期消化吸收，可部分代替膨化饲料使用，且对水质影响较小。

关键词  克氏原螯虾;混菌发酵;发酵饲料;水质

中图分类号  S966.12    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.037

Study on the Application of Fermented Feed in the Feeding of Crayfish

MA Ren-sheng1，GAO Chang-nian2，BAO Jun-jie3 et al

（1.Feixi Animal Disease Prevention and Control Center，Hefei， Anhui 231200;2.Feixi Jiayu Ecological Agriculture Technology Co.， Ltd.，Hefei， Anhui 231200;3.Fisheries Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei， Anhui 230031）

Abstract  [Objective]To optimize the production process of plant-derived protein fermented feed and explore the possibility of fermented feed replacing traditional extruded feed for crayfish.[Method]The mixed fermentation conditions of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were optimized by using small peptide content as indicators. The fermented feed produced by the process conditions was used to raise crayfish. [Result]The optimal fermentation conditions for the mixed fermentation of Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast were as follows： inoculum 15%， solid-liquid ratio 2∶1（g∶mL）， fermentation time 96 h， temperature 32 ℃， and that inoculation proportion with Bacillus subtilis， lactic acid bacteria and yeast was 12∶3∶2. After fermentation of the mixed bacteria， the content of small peptides increased about 10 times， slight decreased in the content of crude fiber and no significant change in the contents of crude protein， crude ash and crude fat. The growth rate of crayfish fed with fermented feed was significantly higher than that fed with extruded feed in the early stage of growth. The pH and dissolved oxygen of the shrimp field in the fermented groups were slightly lower than those in the extruded groups. No significant differences were found in ammonia and nitrogen. [Conclusion]Fermented feed is easier to be digested and absorbed in the early growth stage of crayfish， which can partially replace extruded feed， and it has little effect on water quality.

Key words  Crayfish;Mixed fermentation;Fermented feed;Water quality

基金项目  肥西县科技特派员专项。

作者简介  马仁胜（1965—），男，安徽合肥人，副研究员，硕士，从事水产养殖研究。

收稿日期  2019-11-07

大豆、花生等植物提取油类后的副产物蛋白质含量较高，氨基酸组成合理，价格便宜且资源丰富[1-2]。但由于其含有多种抗营养因子、氨基酸不平衡、功能性营养物质缺乏且适口性较差，不适合直接用于饲喂动物[3-6]。如何提高豆粕和花生粕等植物蛋白源的饲用价值，受到越来越多学者的关注。

常见的发酵饲料是由玉米、大豆和花生等通过微生物发酵后干燥压制而成。其蛋白含量与传统饲料相近，有利于降低水产动物饲喂的成本，提高养殖收益。笔者拟优化枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌协同发酵杂粕的生产工艺，并初步探究饲喂发酵饲料对克氏原螯虾生长以及水质情况的影响，旨在为生物发酵饲料在克氏原螯虾养殖中的实际应用提供参考[7-9]。

1  材料与方法

1.1  材料与菌种

豆粕和玉米粕：由安徽万士生物制药有限公司提供，粉碎过40目筛;

无菌水：蒸馏水分装，121 ℃ 灭菌 20 min;

枯草芽孢杆菌：由实验室分离所得;

植物乳酸菌：购自安徽万士生物制药有限公司;

酿酒酵母菌：购自安徽万士生物制药有限公司。

1.2  培养基配制

1.2.1  液体种子培养基配制。

LB培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调pH至7.0，121 ℃高压灭菌20 min。

MRS培养基：酵母膏5 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、柠檬酸氢二胺2 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 g、乙酸钠5 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.6 g、硫酸锰0.2 g、琼脂15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调pH至6.6，121 ℃高压灭菌20 min。

YPD培养基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2.2  发酵种子液的制备。

首先将枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌接于各菌种的液体种子培养基中，分别为LB培养基、MRS培养基和YPD培养基。将枯草芽孢杆菌置于35 ℃、180 r/min摇床振荡培养，酿酒酵母菌置于30 ℃、180 r/min摇床振荡培养，乳酸30 ℃静置培养。培养48 h后，将上述菌液按1%的接種量分别接种到各菌种的液体种子培养基中进行扩大培养。

1.3  混菌发酵杂粕试验设计

1.3.1  混菌发酵杂粕菌种比例优化。

采用正交试验设计，将3个菌种分别以不同接种量进行3因素3水平正交试验，每组设定重复。

发酵条件为温度32 ℃、固液比2∶1（g∶mL）、发酵时间48 h、pH 70。以发酵结束产的小肽含量为考察指标，确定3菌种混合发酵时的最佳比例。混菌发酵杂粕的菌种接种比例的正交试验设计如表1所示。

1.3.2  混菌发酵杂粕条件的优化。

在确定3个菌种的最佳接种比例的基础上，采用正交试验设计，对混菌发酵杂粕的接种量（A）、固液比（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）4个因素进行优化，每个因素设3个水平，进行4因素3水平正交试验。优化混菌发酵条件的正交试验设计如表2所示。

1.4  测定方法

发酵结束后，将发酵产物于烘箱中45 ℃烘至恒重，静置24 h，然后粉粹过60目筛，进行指标测定。小肽含量测定参照轻工行业标准《大豆肽粉》（QB/T2653—2004）中方法;粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法;粗脂肪含量测定采用索氏抽提法;水质测定采用YSI多参数水质测定仪。

1.5  数据统计与分析

数据用Excel进行初步处理后，做统计分析，其中正交数据采用一般线性模型单变量进行极差与方差分析，其他采用单因素方差分析。

1.6  田间饲喂管理

7—9月，在肥西县稼渔水产有限公司基地的5#～8#稻虾共生池塘比较不同饲料的功效。同样水源情况下，池塘面积均为0.33～0.47 hm2，放养虾苗体重为5～7 g，放养密度8尾/m2，养殖周期90 d。5#、6#仅投喂发酵饲料，7#、8#仅投喂传统膨化饲料，日投喂量约为虾体重4%。每10 d从试验的各个稻虾塘随机捞取20尾克氏原螯虾样本测量总体重，并测量水体溶解氧、pH、氨氮。

2  结果与分析

2.1  混菌发酵菌种比例试验结果

由正交试验结果（表3）可知，3个菌种对发酵杂粕产小肽的影响程度为 A>B>C，即枯草芽孢杆菌对发酵产肽的贡献最大，其次是乳酸菌，酵母菌对发酵效果的贡献最小。方差分析结果显示，3个菌种对发酵产物中小肽含量均没有显著影响（P>0.05）。此次试验中枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌混合发酵杂粕的最佳接种比例为A3B3C2，即混菌发酵的菌种比例为枯草芽孢杆菌∶乳酸菌∶酵母菌=12∶3∶2。

2.2  混菌发酵工艺条件优化试验结果

由正交试验结果（表4）可知，4种因素对发酵产肽的影响程度为 A>C>D>B，即接种量对发酵产肽的影响最大，其次是发酵时间，固液比和温度对发酵效果的影响较小。方差分析结果显示，接种量和发酵时间对发酵产物中小肽含量有显著影响（P<0.05）。结合k值大小分析可得，3个菌种混合发酵豆粕工艺条件的最佳组合为A2B3C3D2，即在接种量为15%、固液比为2∶1、发酵时间为96 h、温度为32 ℃的条件下，可以取得最优发酵效果。

2.3  杂粕发酵前后理化性质变化

杂粕发酵前后主要营养物质含量发生变化，小肽、粗蛋白、粗纤维、灰分和粗脂肪的含量（相对干物质）变化如表5所示。杂粕经混菌发酵后，小肽含量变为17.92%，显著高于未发酵组;粗纤维含量有所降低;粗蛋白、灰分和粗脂肪含量变化不明显。

2.4  不同饲料饲喂克氏原螯虾生长的结果

从虾苗投放开始计，每10 d从试验的各个稻虾塘随机捞取20尾样本测量总体重。由表6可以看出，投喂发酵饲料一组的虾在生长初期体重增长速率明显高于投喂膨化飼料一组的虾。但从虾的生长中期开始，膨化饲料组虾的增重速率就开始超过发酵饲料组。

2.5  水质监测结果

从虾苗投放开始，每10 d对水体的溶解氧、pH、氨氮进行测量，试验结果如表7所示。由表7可以得到，发酵饲料组虾田pH和溶解氧都低于膨化饲料组，2组试验虾田的氨氮对比差异不明显。

3  讨论

混菌发酵杂粕试验表明，发酵前后营养物质含量存在较明显变化。该试验中原料经3种微生物混合发酵处理后，小肽含量较未发酵前提高了约10倍，但前后的粗蛋白质含量变化不显著。小肽含量的升高是因为微生物发酵可以把豆粕中的蛋白质水解为氨基酸、多肽等小分子物质[10-12]。同时蛋白质含量变化不大，说明发酵过程中微生物虽然消解了部分植物蛋白，但同时有新的蛋白质产出，可能是菌体发酵过程中转化而成的。可见在发酵过程中，微生物繁殖时能将豆粕中不易消化的植物蛋白质转化为菌体蛋白，改良了豆粕中蛋白质的品质[13-15]。

饲喂试验中，发酵饲料组的克氏原螯虾在生长初期重量增长速率较快，可能是因为饲料中含有的发酵菌进入幼虾的消化道辅助消化，进而促进虾的生长。豆粕经发酵水解后产生的小分子蛋白、小肽也便于虾的消化利用[16-17]。并且发酵饲料所用的菌体在贮存期仍然继续繁殖发酵，使饲料产品具有香味进而有较好的诱食性。但当克氏原螯虾达到生长中期，膨化饲料组虾的增重速率就开始超过发酵饲料组，可能是因为发酵饲料质地松散，投入水中容易消散，大体格虾觅食时难以发现成块饲料，影响摄食，导致增重缓慢。

饲喂2种饲料对水质的影响差异不明显。发酵饲料组含氧量略低，可能因为饲料中含有较多微生物，增加了额外的氧气消耗。氨氮及pH都较为稳定，没有出现坏水情况。

4  结论

（1）通过研究表明，枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌3个菌种的混合菌固态发酵豆粕最佳工艺条件为接种量15%、固液比2∶1、发酵时间96 h、温度32 ℃，且混合菌中枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌的比例为 12∶3∶2。

（2）豆粕经过混合菌发酵后，大分子蛋白质被降解，小肽含量提高了约10倍，粗纤维含量有所降低，粗蛋白、灰分和粗脂肪含量变化不明显。

（3）用混合菌发酵饲料饲喂克氏原螯虾，虾在生长初期重量增长速率明显高于投喂膨化饲料一组的虾，可以考虑在克氏原螯虾养殖前期替代发酵饲料使用，使用发酵饲料对水质的影响与膨化饲料相比，差异不大。

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