地锦草与5种抗菌药联用对猪链球菌的体外抑菌效果

江超　姚飞虹　张之怡　程庆　罗稀楷　李嗣忻　舒宇　王歧本

摘要  [目的]探究地锦草与其他抗菌药物对猪链球菌的体外联合抗菌效果，达到有效防止猪链球菌的目的。[方法]采用琼脂稀释法、微量肉汤棋盘稀释法，分别测定了地锦草与庆大霉素、青霉素、头孢曲松、阿莫西林、硫酸链霉素对3株猪链球菌的最小抑菌浓度（MIC）及分级抑菌浓度指数（FIC）。[结果]地锦草和5种抗菌药联用后对3株链球菌的MIC有不同程度的降低，联用后都表现为相加或协同效果。[结论]地锦草在体外与5种抗菌药联用可减少抗菌药物用量，增强药物对细菌的抑制作用。

关键词  地锦草;抗菌药物;体外联合药敏试验;猪链球菌

中图分类号  S853.7    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0114-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.034

Antibacterial Effect of Euphorbia humifusa Combining with Five Antimicrobials against Streptococcus suis in vitro

JIANG-Chao1，YAO Fei-hong2，ZHANG Zhi-yi1 et al

（1.The Basic Medical College of Xiangnan University，Chenzhou，Hunan  423000;2.Pharmacy College of Xiangnan University，Chenzhou，Hunan  423000）

Abstract  [Objective]In order to effectively prevent Streptococcus suis，  Euphorbia humifusa combining with five antimicrobials against S. suis in vitro was studied. [Method]The classical agar dilution method and micro broth checkerboard dilution method were used， the sensitivity effects of Euphorbia humifusa combining with gentamicin，streptomycin sulfate，penicillin，ceftriaxone，amoxicillin againsts three serotypes S. suis were tested in vitro，the minium inhibitor concentration（MIC）and the fractional inhibitory concentration（FIC） were calculated.[Result]After combining， the MIC of the Euphorbia humifusa and the five kinds of antibacterials to the three strains of S. suis had different degrees of reduction， the combined effect was additive or synergistic.[Conclusion]It is suggested that the combination of five kinds of antibacterial with Euphorbia humifusa in vitro can reduce the antibacterial drugs and enhance the inhibitory effect of drugs on bacteria.

Key words  Euphorbia humifusa;Antimicrobials;Combined susceptibility test in vitro;Streptococcus suis

基金項目  湖南省教育厅科研项目（2015C1286，2016C1492）;湘南学院2018学年校级实验室开放项目（27）;湖南省普通高等学校重点实验室湘南学院心脑血管天然药物研究实验室项目（XN2017K05）。

作者简介  江超（1982—），女，湖南株洲人，硕士，从事药理与毒理研究。 *通信作者，教授，硕士，从事微生物学研究。

收稿日期  2019-08-19;修回日期  2019-08-30

抗生素是常用的一种药物，但是随着抗生素的滥用与乱用，耐药菌株也越来越多地出现，同时抗生素的残留和副作用使得抗生素的使用令人堪忧。近年来，随着人们对健康环保意识的增强，中药研究成为国内外学者研究的热点，中药中的许多成分如有机酸、生物碱、黄酮类、苯醌等成分都有一定的抗菌作用，且中药具有低残留、不易诱导细菌产生耐药性等优点[1-4]，但是由于中药的抑菌活性比较小、应用成本高、疗效比较慢的缺点使得其在临床应用中受到了一定的制约。中药与抗菌药物联用防治细菌性疾病成为现在研究的热点[5-8]。猪链球菌病是一种人畜共患的细菌性疾病，该病给全球养猪业造成了非常大的经济损失，也危害公众健康安全，猪链球菌感染人导致人患脑膜炎、眼内炎等，其中出现脑膜炎的概率最高，我国曾出现过几次感染人的事件[9]。地锦草是一种常见的中草药，具有清热解毒、抗菌止泻等作用，关于地锦草应用和抑菌作用的报道比较多，但是关于地锦草与抗菌药物联用对猪链球菌的抑菌作用效果鲜见报道[10-13]。该研究旨在观察地锦草与抗菌药物联用对临床分离的猪链球菌的体外抑菌效果，以期为临床合理用药提供指导，达到有效防治猪链球菌病的目的。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株。

猪链球菌3株，编号分别为SS2 、SS7 、SSm，分离自郴州地区某大型猪场。 质控菌株肺炎链球菌（编号ATCC49619），购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2  药物与试剂。

抗生素：青霉素、头孢曲松、庆大霉素、阿莫西林、硫酸链霉素均为国产药，市购，按《中华人民共和国药典》要求鉴定合格，使用时均在有效期内。

中药：地锦草，自采，按《中华人民共和国药典》要求鉴定合格。

培养基：脑心浸出液肉汤培养基（brain heart infusion broth，BHI）（批号：20181126）、琼脂粉（批号：20190322）、小牛血清（购自杭州四季青生物工程材料有限公司）。

1.1.3  主要仪器设备。

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备公司）;恒温恒湿培养箱;电热鼓风干燥箱;立式电热压力蒸汽灭菌器（上海博迅公司医疗设备厂）;AUW120D 型电子天平（日本岛津）;微量可调移液器（德国Eppendorf公司）;SHA-B型水浴恒温摇床等。

1.2  方法

1.2.1  抗菌药物母液的配制。

用十万分之一电子天平准确称取适量青霉素、庆大霉素、阿莫西林、硫酸链霉素、头孢曲松，分别配制成浓度为2 560 μg/mL的母液50 mL，过滤除菌，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2  地锦草水提液的制备。

称取地锦草干燥粉末20 g，加入200 mL蒸馏水，浸泡30 min后煮沸，煎煮计时30 min，在煎煮过程中要注意搅拌，煎煮3次，每次煎得的药液和药渣都用纱布趁热过滤，合并3次滤液后，浓缩至生药浓度为1 g/mL，即为地锦草水提液。过滤除菌，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3  菌悬液的制备。

将菌种从-80 ℃冰箱中取出，在超净工作台中用接种环划线接种于含5%小牛血清脑心浸出液的琼脂培养基上，37 ℃培养18～24 h;观察菌落的形态特点，挑取单个菌落接种到脑心浸出液肉汤培养基中增菌培养，37 ℃振荡培养18～24 h;调整菌液浓度至0.5麦氏比浊度，使用时用生理盐水进行稀释。

1.2.4  单独用药时最小抑菌浓度（MIC-single，简写MIC-s）的测定（琼脂稀释法）[14]。

分别测定地锦草提取液、青霉素、硫酸链霉素、头孢曲松、庆大霉素、阿莫西林对3株猪链球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitoty concentration，MIC）。

分别取2 mL对倍稀释的上述抗生素溶液加入18 mL灭菌的含5%新生小牛血清的BHI琼脂培养基（注意培养基温度冷却至50 ℃），混匀后倒入平板，冷却，各药物设置15个浓度（最终浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0125、0.062 5、0.031 25 、0.015 6 μg/mL）。每个浓度3个重复，将麦氏比浊度为0.5的菌液用生理鹽水稀释100倍后，用微量移液器吸取1～2 μL菌液接种于已制备好的含药平板表面，待菌液吸收后置于37 ℃恒温恒湿培养箱培养18～24 h，观察结果，以无菌生长（单个菌落忽略不计）的最低浓度为该药单独用药时的MIC-single。

1.2.5  联合药敏试验（微量肉汤棋盘法）[15]。

取96孔无菌微孔板，在方阵的横列中，将地锦草用灭菌BHI肉汤进行倍比稀释;在方阵的纵列中，将青霉素用灭菌BHI肉汤进行倍比稀释，使地锦草和青霉素初始孔的终浓度分别为单独用药时MIC的2倍，共稀释6个浓度，2种药物的量各为50 μL，最后在无菌微孔板中加入100 μL菌液，使最终菌液浓度为5×105 CFU/mL，37 ℃振荡培养18～24 h（设3个重复），观察结果。选择最佳组合效应时，2药联合时的各自的MIC（MIC-combined，简写MIC-c）。通过计算抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration，FIC）判断相互作用。

地锦草与硫酸链霉素、阿莫西林、头孢曲松、庆大霉素的联合药敏方法同青霉素，结果见表2～4。

FIC=A药MIC-combined/A药MIC-single +B药MIC-combined/B药MIC-single，FIC指数≤0.5表示两药具有协同作用;>0.5～1.0表示相加作用;>1.0～2.0表示无关;>2.0表示拮抗作用[15]。

2  结果与分析

2.1  各药物单独用药时的最小抑菌浓度（MIC-s）

由表1可知，地锦草水提液对3株猪链球菌都有一定的抑菌作用，MIC为生药浓度1.25×105 μg/mL，按照郎利敏等[16]介绍的判断标准，处于中度敏感程度（MIC<7.80 mg/mL 为高度敏感，7.80 mg/mL≤MIC<250 mg/mL为中度敏感）。5种抗菌药物的MIC结果显示，3株猪链球菌对5种抗菌药物都不同程度地产生了一些耐药，有些菌株还产生了多重耐药。

2.2  地锦草与5种抗菌药物对猪链球菌的体外联合抑菌试验结果

由表2～4可知，联合药敏试验的FIC在0.5～1.0，属于相加或协同作用，其中地锦草与头孢曲松的联合效果为协同，其余为相加。联合用药后药物的MIC值较单独用药时的MIC值都有不同程度的降低，地锦草联合用药后的MIC为单独用药的1/4～1/2，5种抗菌药物联合用药后的MIC为单独用药时MIC的1/8～1/2。

3  结论与讨论

（1）地锦草是一种常见的中草药，有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，关于地锦草的抗菌作用研究报道很多，贾艳华等[8]测定地锦草水提液对鸡致病性大肠杆菌的最小抑菌浓度为7.813～31.250 mg/mL;严晗光等[17]测定地锦草水提液对猪源性致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度为62.5 mg/mL，这与该试验结果基本一致，中药的药物剂量要远远大于西药的药物剂量。该试验选取的5种抗菌药物是临床常用的抗菌药，试验结果提示目前猪链球菌的耐药形势比较严重，因此一旦确诊为该菌感染，应通过药敏试验进行选药，不能盲目用药。

（2）中药和抗菌药物联用后具有取长补短的作用，大量试验证明中药和抗菌药物联用后，抗菌药物的使用量都得到大幅度的降低，从而减少了药物对机体的毒副作用，同时又克服了中药单独用药的缺陷。潘任桃等[7]将茶皂素与4种抗菌药物联用，测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，联合用药时4种抗菌药物的MIC为单独用药时的1/32～1/4。关于中药增强抗菌药物疗效的机制有文献报道说可能是中药成分中的一些具有表面活性的物質加大了抗菌药物与细菌接触的表面积，提高了抗菌药物的有效浓度或是中药对细菌造成的氧化性损伤增强了病原菌对抗菌药物的敏感性[7]。也有资料报道说中药和西药联用后，中药可影响后者的体内过程，如茵陈浸膏可促进灰黄霉素的吸收，枳实可提高胆道庆大霉素的浓度[18]等，中西结合抗菌机理还有待进一步的研究。但是并不是中药和抗菌药物联用后都能起到协同或相加的作用，贾艳华等[8]通过试验发现地锦草与恩诺沙星、黏菌素等药物联用后会产生拮抗作用，在临床使用联合药物时不能盲目乱用。

（3）该试验选用的3株菌均为临床分离的菌株，其中的2型猪链球菌为人畜共患的致病菌，地锦草与抗菌药物联用后显示出很好的效果，它可以提高疗效，降低抗菌药物的用量，减少毒副作用，扩大应用范围，并能发挥单独使用中药或抗菌药所不能取得的治疗作用。但是该试验只是在体外试验，在体内是否有抗菌作用还是一个未知数，要使其真正应用于临床，必须结合体外体内的综合效益评价，建立更准确有效的检测系统，确保药物安全和有效。

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