CK34βE12、Galectin-3在PTC中的诊断作用及与BRAFV600E关系的研究

杨玲玲 何凯 顾华敏

[摘要] 目的 研究CK34βE12、Galectin-3在甲状腺乳头状癌（PTC）中的表达以及与BRAFV600E基因突变的关系，评价其在甲状腺乳头状癌中的临床诊断价值。 方法 收集2017年6月～2018年6月在我院接受治疗的230例甲状腺乳头状癌患者的甲状腺乳头癌组织及其癌旁组织，采用免疫组织化学法检测CK34βE12、Galectin-3的表达情况，AMERS法检测BRAFV600E，采用χ2检验方法分析CK34βE12、Galectin-3蛋白阳性率与BRAFV600E基因突变率关系。 结果 在PTC组织中，CK34βE12、Galectin-3呈强阳性表达（P<0.01），与患者年龄、性别、是否淋巴结转移等均无关联（P>0.05）;BRAFV600E基因在PTC中有84.3%突变;BRAFV600E基因突变率与患者年龄、性别、是否淋巴结转移等无关联（P>0.05），与CK34βE12、Galectin-3蛋白表达无关联（P>0.05）。 结论 PTC组织中，CK34βE12、Galectin-3对鉴别甲状腺良恶性具有重要临床意义，但CK34βE12、Galectin-3表达升高与BRAFV600E基因突变的相互关系，還需要进一步研究。

[关键词] 甲状腺乳头状癌;CK34βE12;Galectin-3;BRAFV600E

[中图分类号] R737.9;R737.25          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）30-0131-04

Study on the diagnostic effect of CK34βE12 and Galectin-3 in PTC and its relationship with BRAFV600E

YANG Lingling HE Kai GU Huamin FAN Guangmin YU Yingzhi CAO Xuequan CHEN Qi LU Hongsheng

Department of Pathology， Taizhou Central Hospital （Taizhou University Hospital） in Zhejiang Province， Taizhou   318000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of CK34βE12 and Galectin-3 in papillary thyroid carcinoma （PTC） and its relationship with BRAFV600E gene mutation， so as to evaluate its clinical diagnostic value in papillary thyroid carcinoma. Methods 230 cases of thyroid papillary carcinoma and adjacent tissues who were treated in our hospital from June 2017 to June 2018 were collected. The expression of CK34βE12 and Galectin-3 was detected by immunohistochemistry. The BRAFV600E gene was detected by the AMERS method. The χ2 test method was used to analyze the relationship between the positive rate of CK34βE12 and Galectin-3 protein and the mutation rate of BRAFV600E gene. Results CK34βE12 and Galectin-3 were strongly positively expressed in PTC tissues （P<0.01）， and were not associated with age， sex， and lymph node metastasis（P>0.05）， the BRAFV600E gene showed 84.3% mutations in PTC; the BRAFV600E gene mutation rate was not associated with age， gender， lymph node metastasis （P>0.05）， and was not associated with CK34βE12 and Galectin-3 protein expression（P>0.05）. Conclusion CK34βE12 and Galectin-3 in PTC tissues have important clinical significance in the differential diagnosis of benign and malignant thyroid. However， the relationship between the increased expression of CK34βE12 and Galectin-3 and the mutation of BRAFV600E gene needs further study.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; CK34βE12; Galectin-3; BRAFV600E

甲状腺癌在我国以每年20%的速度持续增长[1]，甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是临床较为常见病变，恶性程度较低，约占甲状腺癌的85%，但其发病率多为年轻人群，且近年呈现发病率上升趋势[2-4]。在PTC的疾病发生发展中，常有特异性标志物的上调或下调表达，从而辅助诊断，采用免疫组织化学方法检测PTC关键标志物是临床诊断重要依据，高分子量细胞角蛋白CK34βE12、细胞黏附凝集素Galectin-3在甲状腺乳头状癌中上调表达[5-6]。同时BRAFV600E的基因突变在PTC中具有普遍性，有研究报道BRAFV600E突变参与了基因调控，与疾病的发生发展存在调控作用[7-8]。因此，PTC中特异性标志物的表达水平变化是否与分子水平的BRAFV600E之间存在相关性值得关注。本文旨在探讨CK34βE12、Galectin-3在PTC检测中的作用及其上调表达与BRAFV600E突变的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2017年6月～2018年6月在我院接受手术治疗的PTC患者230例，其中男53例，女177例，年龄26～70岁，平均（48.05±11.01）岁，以上患者临床资料完整，均经手术及病理确诊，术前未接受其他治疗。

1.2 实验试剂

鼠抗CK34βE12、Galectin-3及En VisionTM試剂均购自厦门迈新生物技术开发公司。BRAFV600E基因突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司。

1.3方法

取患者组织石蜡包埋蜡块，4 μm厚连续切片，HE染色对照。免疫组织化学采用En VisionTM二步染色法，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。每批实验均设置阳性和阴性对照。按照试剂说明书提取石蜡包埋组织DNA，经ABI7500荧光定量PCR仪行AMERS法检测BRAFV600E基因突变。

1.4评价指标

免疫组化结果经2位病理医师独立阅片和诊断，综合判定结果。CK34βE12以胞质内出现棕黄色颗粒分布为阳性，Galectin-3以胞质/胞核内出现棕黄色颗粒分布为阳性。分子诊断以样本的FAM信号Ct值≥28，为阴性;样本的FAM信号Ct值<28，为阳性。

1.5统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 CK34βE12、Galectin-3表达情况

230例PTC标本中，CK34βE12在肿瘤组织中阳性率95.2%，在癌旁对照组织中阳性率7.8%;Galectin-3在肿瘤组织中阳性率98.7%，在癌旁对照组织中阳性率9.6%。两种标记物在PTC与癌旁良性组织中表达率差异具有统计学意义（P<0.01），见表1。CK34βE12、Galectin-3典型阳性表达图谱见封三图11～14。

2.2 CK34βE12、Galectin-3在PTC中的表达及与临床病理关系

在与疾病进展的关键性指标中，年龄、性别、是否淋巴结转移等，CK34βE12、Galectin-3的表达均无关联（P>0.05），见表2。

2.3 BRAFV600E突变与临床病理关系

在收集的230例PTC标本中，突变例数194例，突变率84.3%，其与年龄、性别、是否淋巴结转移等均无关联（P>0.05），见表3。

2.4 PTC组织中BRAFV600E突变与CK34βE12、Galectin-3表达的相互关系

CK34βE12、Galectin-3在BRAFV600E基因突变组的表达率分别为95.4%（185/194）、98.4%（191/194），在BRAFV600E基因未突变组的表达率分别为94.4%（34/36）、100%（36/36），BRAFV600E基因是否突变与两种蛋白的表达无关联（P>0.05），见表4。

3讨论

甲状腺癌是较为常见的临床恶性肿瘤，尤其在女性中高发，发病率不但逐年上升，且呈年轻化趋势，是当前威胁我国的十大癌症之一[9]。甲状腺癌乳头状癌是甲状腺癌中最常见类型，虽然大部分甲状腺癌乳头状癌预后良好，5年生存率>90%[10]，但这类疾病的高发趋势需要引起重视，临床治疗中也需要快速鉴别诊断。免疫组化依然是当前甲状腺癌乳头状癌诊断的主要手段，特异性标志物在甲状腺癌乳头状癌诊断发挥重要作用[11-13]。CK34βE12表达于鳞状上皮、导管上皮和其他复层上皮，能够在前列腺基底细胞胞质中特异性着色，与p63、PSA、p504S等联用在前列腺癌诊断中具有重要作用[14]，但目前发现CK34βE12特异性表达于PTC组织中，是鉴定甲状腺良恶性的有效标志物，本研究的230例PTC患者中，CK34βE12阳性表达率95.2%。Galectin-3是一个同型细胞黏附凝集素，主要作用和同类细胞间的黏附有关，并且作为肿瘤恶化程度的参考指标，本研究的230例PTC患者中，Galectin-3阳性表达率98.7%。上述抗体证明是PTC诊断中的特异性标记物，且指标敏感，便于临床开展。

分子病理在当前病理诊断及临床用药指导中发挥不可替代作用，BRAFV600E是RAF基因家族成员之一，BRAFV600E突变在甲状腺乳头状癌高发[15-17]，同时有文献报道BRAFV600E突变在甲状腺乳头状癌中与RET重排有关[18]，提示可能与肿瘤的发生与进展存在关系，BRAFV600E在PTC中的高发突变，有助于临床诊断。在本实验中，BRAFV600E基因在PTC中有84.3%的突变率，其与免疫组化特异性标志物的联合检测有助于PTC的诊断，同时其高发突变可与超声引导细针穿刺活检（Fine needle aspiration biopsy，FNAB）相结合，对于术前难以诊断或不确定标本如果发生BRAFV600E基因突变，即可提示PTC可能，在术前诊断中发挥重要作用，因此具有重要的临床辅助价值。BRAFV600E突变以何种方式调控PTC的发生与进展，尚不明确。王海莹等[19]报道认为BRAFV600E突变与淋巴结是否转移间存在相关性，但目前的试验并未证实上述观点，可能与扩大样本量筛查相关。Guan X等[20]报道发现在BRAFV600E突变组织中，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）存在下调，证实在MAPK信号通路中起重要作用。BRAFV600E突变与PTC中过度表达或缺失表达蛋白之间是否存在特定调控关系，值得探讨。在本实验中，CK34βE12、Galectin-3均为甲状腺乳头状癌中特定表达的抗体，但其在蛋白表达水平与BRAFV600E的突变表达并无相关性，提示需要进一步在分子机制中寻找原因，相关的机制需要进一步研究。本实验的研究证实，CK34βE12、Galectin-3与BRAFV600E突变检测联用，有助于精确诊断PTC，且便于常规开展，BRAFV600E可有效与术前诊断相结合，在临床检测中具有重要的价值。

[参考文献]

[1] 高明，郑向前. 甲状腺癌过去与未来十年[J]. 中国肿瘤临床，2018，45（1）：1-5.

[2] Miyauchi A，Ito Y，Oda H. Insights into the management of papillary microcarcinoma of the thyroid[J]. Thyroid，2018，28（1）：23-31.

[3] Ito Y，Miyauchi A，Oda H. Low-risk papillary microcarcinoma of the thyroid： A review of active surveillance trials[J]. Eur J Surg Oncol，2018，44（3）：307-315.

[4] Miyauchi A，Kudo T，Ito Y，et al. Estimation of the lifetime probability of disease progression of papillary microcarcinoma of the thyroid during active surveillance[J]. Surgery，2018，163（1）：48-52.

[5] Choi YL，Kim MK，Suh JW，et al. Immunoexpression of HBME-1， high molecular weight cytokeratin， cytokeratin 19， thyroidtranscription factor-1， and E-cad in thyroid carcinomas[J]. J Korean Med Sci，2005，20（5）：853-859.

[6] Rago T，Scutari M，Loiacono V，et al. Low elasticity of thyroid nodules on ultrasound elastography is correlated with malignancy， degree of fibrosis， and high expression of galectin-3 and fibronectin-1[J]. Thyroid，2017，27（1）：103-110.

[7] Lanzilotta SG，Grammatica L，Paradiso A，et al. BRAF in papillary thyroid carcinoma[J]. Cell Oncol，2007，29（4）：269-277.

[8] Tufano RP，Teixeira GV，Bishop J，et al. BRAF mutation in papillary thyroid cancer and its value in tailoring initial treatment： A systematic review and meta-analysis[J]. Medicine （Baltimore），2012，91（5）：274-286.

[9] Huang M，Yan C，Wei H，et al. Clinicopathological characteristics and prognosis of thyroid cancer in northwest China： A population-based retrospective study of 2490 patients[J]. Thorac Cancer，2018，9（11）：1453-1460.

[10] 季新强，孙俊勇，刘晶. 北京大学肿瘤医院1996-2015年甲状腺癌手术患者临床病理资料回顾性研究[J]. 中国全科医学，2018，21（27）：88-93.

[11] 李锐，李晓丽. 甲状腺癌患者癌组织中CD34、增殖细胞核抗原和内皮细胞特异分子-1的表达及意义[J]. 中国老年学杂志，2018，38（16）：3881-3883.

[12] 周荣景，丁金旺，赵海菲，等. 甲状腺良恶性病变中HCK、HBME-1及TPO的表达及临床价值[J]. 浙江医学，2017， 39（22）：1972-1975.

[13] 袁积汝，陈晓意，吴泽宇. Hedgehog信号通路与甲状腺癌[J]. 中华实验外科杂志，2018，（3）：589-592.

[14] 余涛，朱绍，兴郑松. AMACR（P504S）、P63、34βE12联合检测在前列腺癌早期诊断中的应用[J]. 中华男科学杂志，2007，（3）：222-225.

[15] Fraser S，Go C，Aniss A，et al. BRAF（V600E） mutation is associated with decreased disease-free survival in papillary thyroidcancer[J]. World J Surg，2016，40（7）：1618-1624.

[16] Zhou D，Li Z，Bai X. BRAFV600E and RET/PTC promote proliferation and migration of papillary thyroid carcinoma cells in vitro by regulating nuclear factor-κB[J]. Med Sci Monit，2017，23：5321-5329.

[17] 侯卫东，胡学信，刘艳峰. 甲状腺乳头状癌中CyclinD1表达和BRAF（V600E）突变的相关性及意义[J]. 临床与实验病理学杂志，2014，（12）：1386-1390.

[18] Henderson YC，Shellenberger TD，Williams MD. High rate of BRAF and RET/PTC dual mutations associated with recurrent papillary thyroid carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2009，15（2）：485-491.

[19] 王海瑩，金美善，马洪喜， 等. 甲状腺乳头状微小癌中survivin、galectin-3、TPO蛋白表达与BRAFV600E基因突变关系的研究[J]. 中国免疫学杂志，2014，（11）：1462-1466.

[20] Guan X，Wang P，Chi J，et al. Relationships of BRAF mutation and HMGB1 to papillary thyroid carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，486（4）：898-903.

（收稿日期：2019-04-28）