云芝糖肽对氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结直肠癌模型中相关肠道菌的影响及潜在意义

韩达，王玉成，冯慧琴，程乐乐，杨晓彤

1. 上海师范大学, 上海 200234； 2. 上海芝草生物技术有限公司, 上海 200233

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的肠道恶性肿瘤。世界范围内，CRC的发病率和病死率在癌症中分别排名第3位和第2位[1]。CRC的发生、发展除受遗传因素影响外，慢性肠炎也是其重要的风险因素[2]。

近年来，大量研究表明肠道菌群失调在慢性肠炎及炎症相关CRC的发生、发展中扮演了重要角色。厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius，P.anaerobius)、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila，A.muciniphila)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis,B.fragilis)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum,C.symbiosum)等可能作为致病菌促进肠炎及炎症相关CRC的发展[3-6]。益生菌乳酸杆菌属(Lactobacillusspp.)则在维持肠道健康和调节免疫功能方面具有重要作用[7]。

云芝糖肽(polysaccharopeptide，PSP)是分离自液体深层发酵的云芝(Trametesversicolor, 彩绒革盖菌)Cov-1菌株菌丝体的结合蛋白多糖，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性。近年来研究发现，PSP还可调节人的肠道菌群组成[8-9]，但对慢性肠炎及炎症相关CRC的预防作用及对相关致病菌的影响尚不明确。本研究以氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导小鼠炎症相关CRC模型，探讨PSP对部分相关肠道致病菌的影响，以期为今后进一步研究PSP对CRC的预防和治疗作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠30只，雄性，4周龄，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限公司〔许可证号：SCXK(沪)2017-0005〕。所有动物在洁净动物房内饲养，并按上海市实验动物管理办法[10]操作。所有注射和灌胃药物、饮用水、饲料和垫料均经灭菌处理。

1.2 试剂及材料

AOM购自Sigma公司， DSS(相对分子质量 36 000～50 000)购自MP Biomedicals公司，QuantiNovaTMSYBR®Green PCR Kit (货号：208054)购于QIAGEN公司，E.Z.N.A.®Stool DNA Kit (货号：D4015)购于OMEGA Bio-tek公司，PSP由上海芝草生物技术有限公司提供，发酵设备BIOTECH-5BG购于上海保兴生物设备工程有限公司，实验用细菌引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 试验分组将30只小鼠经过2周的混合共笼饲养后，随机分为对照组、模型组、PSP预防组，每组各10只。

1.3.2 动物模型建立及给药模型组及PSP组于分组后首日腹腔注射AOM(10 mg/kg),7 d后进行3轮DSS处理，每轮处理包括1周2.5% DSS饮水和2周正常饮水，以建立动物模型。自注射AOM当日起，PSP组每日灌胃PSP(650 mg/kg)至实验结束。对照组注射相应生理盐水并维持自由饮食。

1.3.3 疾病活动指数分析DSS处理期间(d7～d70)，每日对小鼠称重，并记录粪便形态和便血情况，按照文献[11]中的规则，进行疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分。

1.3.4 细菌相对丰度测定分别于开始(d0)、中期(d49)、后期(d70 )和处死前(d84 )收集小鼠新鲜粪便，用试剂盒提取总DNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，real-time qPCR)，对各菌的特异性引物进行扩增，以细菌16S通用引物作内参，计算各菌相对丰度。具体步骤和条件按试剂使用说明进行。获得的Ct值以2-ΔCt·104表示各菌种(属)的相对丰度，其中ΔCt=Ct特异引物-Ct16S通用引物。各引物序列如表1所示。

表1 Real-time qPCR细菌引物序列

Tab.1 Primer sequences for bacterial real-time qPCR

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PSP缓解小鼠肠炎症状及降低DAI评分

DSS处理期间模型组和PSP组小鼠均出现稀便、便血及体重减轻等症状，对照组小鼠体重平稳增加且粪便正常。DAI评分模型组、PSP组均显著高于对照组(P<0.001)。第1轮及第2轮DSS处理d7时，PSP组的DAI评分均显著低于模型组(P<0.05和P<0.01，图1A)。第3轮DSS处理后PSP组部分小鼠便血、腹泻症状明显加重，组内差异较大，两组间DAI评分无显著性差异，模型组部分小鼠出现脱肛(图1B)现象，PSP组无脱肛出现。

A: Diseases Active Index of each round DSS,*:P<0.05,**:P<0.01, ns: not significant, ▲: Compare to group control,P<0.001. B: Representative graph of anal prolapse in model group.

图1 PSP对DSS诱导的小鼠DAI的影响

Fig.1 PSP alleviated the increases of DSS-induced mouse DAI scores

2.2 PSP下调4种CRC相关潜在致病菌的相对丰度

2.2.1P.anaerobius的相对丰度对照组P.anaerobius的相对丰度趋于稳定，在不同时间点上无显著变化。模型组的丰度有随时间增加的趋势，且在后期(d70)显著高于对照组(P<0.05)。PSP组该菌相对丰度开始时略高于对照组，但无统计学意义(P>0.05), 在中期(d49)显著低于起始水平(P<0.05)，且在中、后期和结束时均低于模型组(图2A)。

2.2.2A.muciniphila的相对丰度对照组和模型组的A.muciniphila相对丰度未见显著变化。PSP组在中期(d49)显著降低(P<0.01)，且结束前(d84)低于模型组，但没有统计学意义(图2B)。

2.2.3B.fragilis的相对丰度对照组B.fragilis相对丰度无显著变化。模型组相对丰度随时间增加，并在中、后期和结束时均高于对照组，但不显著(P>0.05)。PSP组在中、后期的丰度均显著低于初始水平(P<0.05和P<0.05)，并显著低于模型组(P<0.01和P<0.05)(图2C)。

A: Relative abundance ofP.anaerobius. B: Relative abundance ofA.muciniphila. C: Relative abundance ofB.fragilis. D: Relative abundance ofC.symbiosum. Compare to Day0,*:P<0.05,**:P<0.01.

图2 PSP对肠癌相关潜在致病菌丰度的影响

Fig.2 Effects of PSP on relative abundance of potential pathogenic entero-bacteria associated with CRC

2.2.4C.symbiosum的相对丰度各组内C.symbiosum的相对丰度个体差异较大，对照组的丰度随时间延长无显著变化。模型组相对丰度在中期(d49)有增加趋势，但无统计学意义。PSP组的相对丰度在中期时降低，在中、后期均低于模型组，在d70时两者有显著差异(P<0.05) (图2D)。

2.3 益生菌Lactobacillus spp.的相对丰度不受PSP的影响

与初始水平相比，对照组益生菌Lactobacillusspp.的相对丰度在中期(d49)及以后均有增加，但不显著。模型组该菌的相对丰度在中期(d49)时降低，后期时回升并在结束时超过起始丰度。PSP组该菌丰度变化与模型组相似，在各时间点模型组与PSP组间该菌相对丰度无显著差异(P>0.05)(图3)。

3 讨论

炎症是诱发CRC的重要因素，而肠道菌群的失衡与炎症及CRC的发生也有着紧密联系。抗炎作用和维持肠道菌群的平衡可降低CRC发生的风险[16]。

PSP在临床上通常作为免疫调节剂用于癌症患者术后的辅助治疗， 同时研究发现PSP还具有抗炎作用，可减少脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中炎性因子一氧化氮、前列腺素E2和白细胞介素1β的生成，并下调环氧合酶2和一氧化氮合酶的表达[17]。小鼠灌胃给予PSP还可显著降低二甲苯导致的耳肿胀[18]。近年来一项体外模型研究及哈佛医学院的临床研究发现，PSP还可改变人的肠道菌群组成[8-9]，但PSP对炎症相关CRC的预防作用目前尚未见报道。本研究用AOM/DSS诱导小鼠炎症相关CRC模型后，对模型小鼠给予PSP以探讨PSP对DSS所致炎症的缓解作用及CRC相关肠道菌丰度的影响。

图3 PSP对益生菌Lactobacillusspp.相对丰度的影响

Fig.3 Effects of PSP on relative abundance of probioticLactobacillusspp.

AOM是一种化学诱变剂，可导致DNA烷基化而诱导癌变。DSS是一种人工合成的硫酸盐多糖，其对结肠上皮细胞有毒性作用，小鼠饲喂DSS往往出现以血便、肠道黏膜溃疡和粒细胞浸润为特征的结肠炎症。使用AOM/DSS，在较短的时间内可诱发小鼠炎症相关CRC的发生[19]。本研究中，经DSS处理，小鼠出现体重减轻、便血、稀便等症状， DAI评分显著升高，说明小鼠模型成功建立。试验中PSP组小鼠前两轮给予PSP，结果小鼠的症状减轻并显著降低DAI评分，提示PSP可能通过抗炎机制缓解了DSS导致的结肠炎症，对炎症相关CRC的发生、发展有潜在的预防作用。但第3轮DSS处理后，PSP组因个体差异增加，部分小鼠便血、腹泻症状明显加重，且DAI评分升高，与模型组相比，组间评分无统计学差异，但模型组小鼠出现的脱肛现象未在PSP组发现。如果在该阶段进行结直肠病理分析，进一步观察炎症损伤情况，可能会发现更能清晰反映两组炎症程度的差异。

DSS诱发的炎症可导致小鼠肠道微生物多样性降低、菌群结构显著改变，且菌群紊乱与其导致的免疫系统改变相关[20-21]，而肠道免疫功能的改变反过来对肠道菌群组成也有显著影响[22]。当肠道菌群失衡时，某些肠道细菌丰度增加，通过分泌毒素及其代谢产物或刺激肠道免疫系统可诱发或促进CRC的发生、发展[23]。比如CRC患者的粪便和结肠黏膜组织中P.anaerobius的丰度显著高于健康个体，用P.anaerobius给C57BL/6小鼠灌胃可显著增加结肠增生[3]。本研究中AOM/DSS处理后P.anaerobius相对丰度随时间增加，而PSP则可抑制这种趋势。还有研究发现FabplCre; Apc15lox/+小鼠肠道肿瘤发生率与A.muciniphila的丰度有关，灌胃该菌株显著增加肿瘤发生[4]。本研究中造模及时段并未影响对照组和模型组中A.muciniphila的相对丰度，但PSP组中该菌丰度在各时间点均有低于模型组的趋势，提示PSP也可减少该菌的丰度。产肠毒素型B.fragilis(ETBF)在肠道中的丰度与结肠炎和肿瘤发生呈正相关，用ETBF给ApcMin/+小鼠灌胃可诱导结肠炎和肿瘤发生[5]。本研究发现模型组中B.fragilis丰度高于对照组，而PSP可显著降低该菌丰度，提示PSP对该菌相关的CRC发生具有潜在预防作用。临床研究发现C.symbiosum相对丰度随肿瘤进展增加，且通过C.symbiosum相对丰度对早期CRC的预测性比具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)更好[6]。本研究中对照组和模型组的C.symbiosum丰度都较高，且随时间增加未见明显变化，但给予PSP可降低该菌的相对丰度。其中的机制可能是PSP具有益生元活性，另外PSP是否可能通过调控免疫功能间接影响肠道菌群组成也值得进一步研究。本文采用AOM/DSS诱导小鼠肠炎相关CRC模型，探究了PSP对肠癌相关潜在致病菌及益生菌相对丰度的影响，结果初步表明PSP可减轻小鼠肠炎症状，并可降低肠道潜在致病菌P.anaerobius、A.muciniphila、B.fragilis和C.symbiosum的相对丰度。综上所述，AOM/DSS造模过程中PSP可一定程度降低肠癌相关致病菌P.anaerobius、A.muciniphila、B.fragilis和C.symbiosum的相对丰度，提示PSP可能通过降低CRC相关致病菌丰度对肠炎相关CRC产生潜在的预防作用。PSP对炎症相关CRC的预防作用及其减轻肠炎的分子机制等还需进一步研究。

Lactobacillusspp.是肠道中丰度最高的益生菌属，CRC的发生通常伴随着其丰度的降低[24]，而增加其丰度则有潜在的预防和治疗效果。体外研究发现PSP能够显著提高健康人粪便发酵液中双歧杆菌属和Lactobacillusspp.的丰度[8]。而本研究中造模同时给予PSP并未对Lactobacillusspp.的相对丰度产生明显影响，这可能与体外与体内的环境差异以及模型小鼠和健康人肠道菌群组成差异有关。