大鼠过劳模型心脏Cx43和Cx45的表达

杨博帆，史婧卓，李晶，潘玉蓬，肖宁，余彦耿，张付，王慧君，李冬日

（1.南方医科大学法医学院，广东 广州 510515；2.广东省公安厅 公安部法医病理学重点实验室，广东广州 510050）

据2006年6月22日《环球时报》报道，中国每年有60万人死于过劳，居世界首位，过劳死已经成为我国重大社会问题[1]。但目前国内对于过劳死的研究大多局限在社会学及法学领域，在病理学及病理生理学机制方面的研究较少，在法医病理学诊断方面的研究更为欠缺[2]。根据传统的过劳死概念，过劳可使潜在的疾病急性恶化而突然死亡，根本死因还是潜在的自身疾病，属于猝死范畴[3-4]。然而，本课题组在法医病理学鉴定实践中遇到多例无明显自身疾病且与长时间超负荷劳动密切相关的急死案例，符合日本《关于脑血管疾病与虚血性心脏疾病（负伤引起的除外）的认定标准》的评判标准[5-6]，考虑过劳本身可能对心血管系统产生不良影响。

心脏的缝隙连接通道是心肌细胞间一种特殊的连接通道，缝隙连接通道的基本结构单位是连接子，相邻细胞通过各自的连接子对接形成一个完整的连接通道，每个连接子由6个跨膜蛋白分子即缝隙连接蛋白环形排列围成[7]。缝隙连接通道的重要作用是介导细胞间通讯，主要表现为代谢偶联和电偶联，完成心肌细胞间的化学递质或电信号传递，是维持心肌细胞电生理的结构基础，因此缝隙连接蛋白在维持心脏节律方面发挥着重要作用[8-9]。心脏内的缝隙连接蛋白主要有连接蛋白（connexin，Cx）40、Cx43和Cx45等。Cx40主要分布于心房和近端传导系统；Cx43主要存在于工作的心肌细胞内；Cx45分布于整个传导系统，是窦房结和房室结缝隙连接通道的主要蛋白[7]。近年来许多研究结果[10-19]均表明，Cx43和Cx45的含量与心脏功能相关，Cx43和Cx45的异常表达可能引起心脏功能的改变。

为探究过劳应激是否对心脏功能产生直接影响，本研究建立大鼠过劳应激模型，通过检测左心室心肌细胞中Cx43和Cx45的表达情况，研究过劳应激对心脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠9只，初始体质量300～400g，雌雄不限，由南方医科大学实验动物中心提供。饲料由该实验动物中心提供，每只大鼠分笼饲养，每天投放足量鼠粮和纯净饮用水，大鼠自由饮食。饲养环境为室温25℃、湿度50%，通风流畅，无噪音。光照/黑暗周期为16h/8h，06：00开灯，22：00关灯。本研究经南方医科大学实验动物福利和伦理管理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

将9只大鼠随机分为对照组、过劳1月组和过劳2月组，每组3只。

1.2.2 大鼠过劳模型的建立

过劳组进行强制游泳实验[20]。将过劳组所有大鼠每天同一时间放入水桶中游泳1h（16：00～17：00），水温20～25℃，水深60cm，水桶直径40cm。过劳1月组每只大鼠强制游泳实验持续1个月（30d），过劳2月组每只大鼠强制游泳实验持续2个月（60d）。每只实验大鼠游泳所用的水桶均相互独立。判断劳累的标准是在游泳过程中观察到大鼠的鼻尖被水淹没超过10s且连续发生3次及以上[20]。游泳结束后将大鼠放回笼中，自由活动及饮食。对照组正常饲养，不予强制游泳。

1.2.3 取材

建模结束后，每只大鼠进行称重。采用2%戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，从心尖处刺入针头用生理盐水进行灌注。采用输液滴注方式进行，灌注至大鼠体内血液基本排出，血液排空的判定标准为大鼠肺部呈白色或眼球透明[21-22]。灌注完成后取下大鼠的心脏并称重。计算心脏质量与体质量的比值，即心体比（‰）。切取心脏左心室心尖部，置于-80℃保存备用，其余部分置于多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 心肌细胞Cx43和Cx45的提取和检测

将-80℃保存的左心室心尖部组织取出，液氮冷冻后转移到研磨器中。按1 mL裂解液原液加20 μL蛋白酶抑制剂配制裂解液。按1 mg组织加10 μL裂解液的比例在研磨器中加入裂解液，研磨。研磨后将混合液置入微量离心管中，4℃下以14000×g离心10min。取上清液，按上清液与上样缓冲液以4∶1的比例加入上样缓冲液。振荡，以2 200×g离心15 s，100℃水浴10min，取上清液于-20℃保存备用。

采用Western印迹法对Cx43和Cx45的表达情况进行观察。上胶（浓缩胶）浓度为5%，下胶（分离胶）浓度为10%。上胶100 V固定电压电泳0.5 h，下胶120 V固定电压电泳2 h。200 mA固定电流2.5 h转膜。采用含有聚山梨酯的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐-吐温20（tris buffered saline with tween-20，TBST）配置1∶20脱脂奶粉溶液，用于封闭聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜。一抗（Cx43抗体、Cx45抗体和GAPDH抗体，1∶1 000，美国ABclonal公司）4℃孵育12 h。TBST洗涤条带3次，每次5 min。二抗（山羊抗兔IgG抗体，1∶10 000，美国ABclonal公司）室温孵育1 h。TBST洗涤条带3次，每次5 min。曝光。用ImageJ软件（美国National Institute of Mental Health公司）对曝光条带结果进行灰度值分析。

1.2.5 组织病理学染色方法

取出多聚甲醛溶液固定的心脏，切取左心室壁，冲洗多聚甲醛固定液，乙醇脱水，石蜡包埋。将石蜡组织块以2 μm厚度连续切片并置于载玻片上，37℃培养箱过夜，然后65℃保持2h，石蜡切片用水脱蜡。

苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色：将切片置于苏木精溶液中数分钟，酸水及氨水分色各数秒，流水冲洗1 h后入蒸馏水数秒，70%～90%乙醇溶液由低到高浓度依次脱水各10 min，再入乙醇伊红染色液染色2～3min，无水乙醇脱水，经二甲苯使切片透明。

Masson染色：Masson染色是用来显示组织中纤维的一种染色方法，在镜下观察心肌纤维呈红色，间质纤维呈蓝色。将切片放入Regaud氏苏木精染液中5～10 min，流水充分冲洗后蒸馏水冲洗，Masson丽春红酸性复红液复染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3～5 min，再直接苯胺蓝液染5min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，无水乙醇脱水，经二甲苯使切片透明。最后，切片用中性橡胶包裹覆盖。

1.3 数据统计与分析

运用SPSS 20.0软件（美国IBM公司），采用t检验分别将各过劳组与对照组大鼠的心体比（‰）进行统计学分析。同时，根据灰度值分析结果，将同一样本Cx43和Cx45的灰度值分别与其内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的灰度值相比，根据该比值同样采用t检验对Cx43和Cx45的表达情况进行统计学分析。对两个过劳组大鼠间按相同分析方法对以上数据进行统计学分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 心体比结果

3组大鼠的心体比结果（表1）表明，与对照组相比，2个过劳组大鼠心体比增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。过劳1月组大鼠的心体比与过劳2月组大鼠的心体比之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 3组大鼠的心体比结果 （n=3，±s，‰）

表1 3组大鼠的心体比结果 （n=3，±s，‰）

注：1）与对照组比较，P＜0.05。

组别对照过劳1月过劳2月大鼠心体比3.16±0.15 3.67±0.141）3.73±0.101）

2.2 Cx43和Cx45的表达

用Western印迹法对各组大鼠左心室心尖心肌细胞Cx43和Cx45的表达情况进行分析，结果见图1和表2。结果表明：与对照组相比，过劳组Cx43表达减少、Cx45表达增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；过劳2月组的Cx43表达减少与Cx45表达增加，与过劳1月组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 3组大鼠心肌细胞内Cx43和Cx45的表达情况

表2 3组大鼠心肌细胞内Cx43和Cx45的表达情况（n=3，±s）

表2 3组大鼠心肌细胞内Cx43和Cx45的表达情况（n=3，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05。

组别对照过劳1月过劳2月Cx43 0.62±0.11 0.40±0.041）0.31±0.061）2）Cx45 0.45±0.14 0.74±0.121）0.92±0.081）2）

2.3 组织病理学染色结果

2.3.1 HE染色结果

对照组与过劳组大鼠左心室壁组织的HE染色结果见图2。对照组心肌细胞排列整齐，部分小血管周围检见少量纤维组织。与对照组相比，过劳组的心肌细胞排列较紊乱，心肌肥大，嗜酸性增强，部分心肌纤维断裂，提示可能出现心肌细胞受损和间质纤维增生。

2.3.2 Masson染色结果

对照组与过劳组大鼠左心室壁组织的Masson染色结果见图3。对照组部分小血管周围检见少量纤维组织。与对照组相比，过劳组心肌间质纤维明显增生（图3）。

图2 对照组与过劳组大鼠左心室壁组织的HE染色结果（×100）

图3 对照组与过劳组大鼠左心室壁组织的Masson染色结果（×100）

3 讨 论

“过劳死”（Karoshi，death from overwork）一词起源于日本，最早出现于二十世纪六七十年代日本经济繁荣时期[23]。日本圣德大学教授上畑铁之丞首先提出过劳死的概念，他在《过劳死》一书中提出，过劳死不完全是医学或统计学上的概念，而是工作积累所致，是以过重劳累为诱因，使高血压和动脉硬化等疾病恶化，引起心脑血管疾病急性发作，最后造成永久不能工作甚至死亡的状态，属于社会医学范畴[24]。目前，日本厚生劳动省对过劳死的定义为：由于超负荷劳动，原有的高血压、动脉硬化等自身疾病进一步恶化，诱发心脑血管疾病发作而导致死亡的状态[25]。根据上述概念，患有高血压、冠心病等自身疾病是先决条件，而过度劳累只是诱发因素。日本厚生劳动省在《劳动法》的基础上，于2001年颁布了《关于脑血管疾病与虚血性心脏疾病（负伤引起的除外）的认定标准》，并于2015年进一步对其进行了补充和修改。该项规定也体现了过劳对心脑血管疾病的诱发或加重作用。然而越来越多的研究结果[26-30]显示，过劳本身可能就是引起人体各种疾病的直接原因，如高血压、冠心病、糖尿病、高脂血症、抑郁症等，过劳死的年轻化趋势也是一个佐证[2]，而我们在法医病理学实践中也遇到了一些没有明显基础疾病但与过劳密切相关的急死案例[5-6]，其共同特点是心脏肥大和心肌间质纤维化。

根据本研究结果，过劳大鼠的心体比明显大于对照组，提示过劳应激可能会使心脏质量增加。而心脏质量的增加可能与心肌肥大或纤维结缔组织增生有关[31]，根据HE染色和Masson染色结果，与对照组相比，过劳组大鼠心肌肥大、心肌细胞嗜酸性增强，心肌间质纤维明显增生，提示过劳应激使心肌损伤、心肌间质纤维化，如果过劳应激进一步蓄积，不排除最终导致心力衰竭或心律失常而死亡的可能[32]。过劳大鼠与对照组大鼠左心室壁心肌细胞Cx43和Cx45的Western印迹法结果显示，过劳可使大鼠左心室心尖部心肌细胞内Cx43表达降低、Cx45表达升高，且过劳时间越长，Cx43表达降低或Cx45表达升高越明显。近年来许多研究均证实，缝隙连接通道数目的减少或分布紊乱，将导致心脏的传导异常，从而导致心律失常。Cx43的缺乏会更容易发生室性心律失常[10]，Cx43表达的降低与梗死后室性心律失常和心力衰竭的发病机制有关[11-12]，在持续性心房颤动的心肌细胞中Cx43的表达水平显著下降[13]。与Cx43不同的是，Cx45在工作心肌细胞中表达相对较低的水平[14]，但有研究结果[16-17]表明，Cx45在心力衰竭时表达会增加，并且Cx45表达的增加会提高患心律失常的可能性。因为Cx45可以和Cx43形成异源通道，Cx45与Cx43比值的增加可能减小缝隙连接的大小，也可能诱导病理状态下的心律失常[15，18-19]，即当心肌细胞内Cx43表达降低和Cx45表达升高时，将可能出现心律失常。本研究中Western印迹法结果提示，随着过劳应激时间的延长，发生心律失常的风险也将升高，可能也是心肌受损、心肌间质发生纤维化及心脏质量增加的原因。

本研究初步证实了过劳应激可对心脏功能产生直接的影响，长期过劳应激的蓄积可能是导致死亡的根本原因。