黑曲发酵茯苓多糖免疫调节作用研究

李世杰，李勇，曾海英

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025）

茯苓（Poria cocos），又名茯菟、万灵桂、茯灵等[1]，是寄生于松科植物马尾松或赤松等树根上，担子菌纲非褶菌目多孔菌科的一种，为药食两用真菌，主要功能成分为茯苓多糖，约占茯苓干重的84.2%[2]。茯苓多糖，分子结构多为β-（1→3）-D-葡聚糖，含有少量β-（1→6）糖苷键侧链，具有多重生物活性，如：抗肿瘤、免疫调节、保肝作用等[3-4]。在免疫调节方面，茯苓多糖对特异性和非特异性免疫功能均有促进作用[5]。候玮婷等[6]研究发现灌胃复方茯苓多糖口服液，对小鼠实体瘤有显著抑制作用且能促进小鼠淋巴细胞增殖和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）活性。张秀军等[7]通过体内外给药观察小鼠脾淋巴细胞的增殖作用和巨噬细胞吞唾中性红的能力，结果表明羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachymaran，CMP）可增强巨噬细胞和淋巴细胞的功能，体内外均能显著增强小鼠免疫功能。但茯苓多糖具有的分子量高、结构紧密、水溶性差等特性，生物活性利用率不高[8]。林标声等[9]研究了高取代度羧甲基茯苓多糖的制备工艺及其免疫调节作用，发现羧甲基茯苓多糖具有直接抑制或杀死肿瘤细胞、增强巨噬细胞吞噬、调节机体免疫功能的作用。武洪志等[10]研究黑曲菌发酵茯苓的工艺，发现经黑曲发酵后茯苓中多糖的含量显著增加。然而黑曲菌发酵茯苓在增加茯苓多糖含量的同时，是否能够改变茯苓多糖结构，从而改善其免疫调节作用，目前相关研究鲜有报道。研究以黑曲菌发酵后的茯苓多糖为原料，探究发酵茯苓多糖对免疫低下小鼠的免疫调节作用影响，为茯苓多糖的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茯苓：贵州省黎平县；黑曲菌：贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室；昆明小鼠：重庆腾鑫生物技术有限公司，6周～8周龄，雌雄各半，无特定病原体（specific pathogen free，SPF），体重 18 g～22 g，实验动物合格证号为：SCXK（军）2012-0011；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）测定试剂盒：上海鼓臣生物技术有限公司；环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 仪器与设备

智能生化培养箱（SHP-250型）：上海光都仪器设备有限公司；紫外分光光度计（TU-1810型）：北京普析通用仪器有限责任公司；高速万能粉碎机（FW100型）：天津市泰斯特仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（TGL20M型）：长沙迈佳森仪器设备有限公司；光吸收酶标仪（Spectra Max 190）：美谷分子仪器（上海）有限公司；倒置相差显微镜（MoticAE31型）：麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵茯苓多糖制备

参照文献发酵茯苓并提取茯苓多糖：取适量茯苓，在料水比 1 ∶0.93（g/mL），发酵时间 7.4 d，发酵温度32℃，初始pH值为5.5，接种量为4%的条件下发酵，获得发酵茯苓[10]。取适量发酵茯苓，按照1∶20（g/mL）的料液比加入蒸馏水，沸水浴1 h，趁热抽取滤液，浓缩后加入4倍量的85%的乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，离心除去上清液，沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，冷冻干燥获得发酵茯苓多糖样品[11]。

1.3.2 免疫低下小鼠模型构建

将已适应生活1周的昆明小鼠随机分为空白对照组（CK）、环磷酰胺模型组（cyclophosphamide，CY）、发酵茯苓多糖（fermented Poria cocos polysaccharides，FPCP）高剂量组、FPCP低剂量组4个组，每组小鼠10只。FPCP 高、低灌胃剂量分别为 100、50 mg/kg·BW。各组小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液，剂量为60 mg/kg·BW，连续注射3 d，构建环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。CK组腹腔注射等剂量的生理盐水。小鼠免疫功能低下模型建立后，FPCP高、低剂量组按照各自剂量灌胃，CK及CY组等剂量灌胃生理盐水。

1.3.3 脏器指数测定

连续灌胃小鼠10天后称取体质量并颈椎脱臼处死，在无菌条件下分离胸腺与脾脏并称重。分别计算胸腺与脾脏指数：胸腺指数=10×胸腺质量（mg）/体质量（g）；脾脏指数=10×脾脏质量（mg）/体质量（g）。

1.3.4 血清溶血素水平测定

连续灌胃小鼠6天后，腹腔注射0.2 mL 2%的鸡红细胞悬浮液，在第10天眼球取血，1 500 r/min离心10 min，获取血清，生理盐水稀释100倍。取血清稀释液1 mL，加10%的鸡红细胞悬浮液0.5 mL、10%的补体（豚鼠血清）1 mL，混匀，于37℃下水浴30 min，置于0℃冰箱中止反应。将反应液在1 500 r/min条件下离心5 min，取离心上清液于450 nm波长下测定OD值，以生理盐水作空白调零。

1.3.5 血清IgG与IgM含量测定

连续灌胃小鼠10 d，眼球取血，1 500 r/min离心10 min，取血清，然后按照IgG、IgM试剂盒的使用说明书进行含量测定。

1.3.6 单核-巨噬细胞吞噬率测定

连续灌胃小鼠6天后，于小鼠腹腔注射1 mL浓度为4%的淀粉肉汤，引诱巨噬细胞向腹腔聚集；2 h后，每只小鼠注射1%的鸡红细胞悬液1mL。等待2 h，颈椎脱臼处死，剪开腹壁皮肤，腹腔注射生理盐水2mL，轻柔5 min，吸取腹腔液1 mL均匀涂于载玻片上，于37℃孵育30 min，用生理盐水缓慢冲洗1 min，吹干，染色进行观察。计数：显微镜下观察，以巨噬细胞数200个为记数范围，同时记数其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬率，吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/200。

1.3.7 统计学分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0数据处理软件对实验数据进行统计分析，计量数据用±s表示。所测数据进行正态性检验，符合正态分布且方差齐的数据，采用单因素方差分析法及最小显著差数法（least significant diffierence，LSD）进行多组数据比较；方差不齐时多组比较采用Dunnett's T3法；不服从正态分布的数据进行非参数检验分析。

2 结果与分析

2.1 FPCP对免疫低下小鼠脏器指数的影响

小鼠胸腺与脾脏图见图1，FPCP对免疫低下小鼠脏器指数的影响见表1。

图1 小鼠胸腺与脾脏图片Fig.1 Thymus and spleen pictures of mice

表1 FPCP对免疫低下小鼠脏器指数的影响（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

表1 FPCP对免疫低下小鼠脏器指数的影响（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P＜0.05）。

脾脏指数/（mg/g）CK 49.92±4.85a 90.11±7.26a CY 60 31.16±1.72c 44.13±1.77c CY+FPCP 60+50 34.55±1.31b 48.94±1.49b CY+FPCP 60+100 43.74±5.93a 88.61±3.54a组别 剂量/（mg/kg·BW）胸腺指数/（mg/g）

表1试验数据显示，CY模型组小鼠胸腺和脾脏指数明显偏低，与CK正常组相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，提示CY对小鼠免疫器官有显著的抑制作用，即环磷酰胺致小鼠免疫低下模型构建成功。发酵茯苓多糖高、低剂量组均可使免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数得到不同程度的升高，且呈现剂量效应，说明发酵茯苓多糖对免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数有很强的恢复促进作用。FPCP高剂量组能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数，虽然不能完全使其恢复到正常小鼠的数据状态，但与CK正常组比较无显著性差异（P＞0.05），且高剂量组脾脏指数升高程度与CK正常组相当。

2.2 FPCP对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响

FPCP对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响见表2。

表2 FPCP对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

表2 FPCP对免疫低下小鼠血清溶血素水平的影响（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P＜0.05）。

组别剂量/（mg/kg·BW）溶血素水平（OD450）CK 0.65±0.08a CY 60 0.21±0.11c CY+FPCP 60+50 0.42±0.03b CY+FPCP 60+100 0.53±0.12a

由表2可见，CY模型组小鼠血清溶血素水平较CK正常组明显降低，仅为CK组的32.31%，且差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，提示CY对小鼠血清溶血素水平有显著抑制作用，即环磷酰胺致小鼠免疫低下模型构建成功。高、低剂量的发酵茯苓多糖组小鼠血清溶血素水平与CY组比较均差异显著（P＜0.05），表明发酵茯苓多糖能有效提高环磷酰胺致免疫低下小鼠血清中溶血素含量，且呈现剂量效应。100 mg/kg高剂量发酵茯苓多糖组溶血素水平为CK正常组的81.54%，表明高剂量发酵茯苓多糖具有很好的提高小鼠血清溶血素的作用。

2.3 FPCP对免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影响

FPCP对免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影响见表3。

表3 FPCP对免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影响（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

表3 FPCP对免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影响（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P＜0.05）。

IgM含量/（mg/mL）CK 13.16±0.13a 1.97±0.23a CY 60 7.06±1.38d 1.18±0.02c CY+FPCP 60+50 9.98±0.41c 1.54±0.07b CY+FPCP 60+100 12.79±0.12b 1.95±0.14a组别 剂量/（mg/kg·BW）IgG含量/（mg/mL）

由表3可见，CY模型组小鼠血清IgG与IgM含量较CK正常组明显降低，分别仅为CK组的53.65%、59.90%，且差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，提示CY对小鼠血清中IgG、IgM含量有显著抑制作用，即环磷酰胺致小鼠免疫低下模型构建成功。发酵茯苓多糖高低剂量组IgG、IgM含量较CY组均明显提高，差异显著（P＜0.05），表明发酵茯苓多糖对小鼠血清IgG、IgM含量有显著提升作用，且呈现剂量效应。高剂量发酵茯苓多糖组IgG、IgM含量分别为CK正常组的97.19%、98.98%，相比之下，高剂量发酵茯苓多糖对小鼠血清中IgM含量的提升作用比对IgG更为明显。

2.4 FPCP对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬率的影响

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况见图2，FPCP对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬率的影响见表4。

图2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况Fig.2 Absorption of chicken red blood cells by mouse peritoneal macrophages

表4 FPCP对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬率的影响（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

表4 FPCP对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬率的影响（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差异不显著，不同表示差异显著（P＜0.05）。

组别剂量/（mg/kg·BW）吞噬率/%CK 50.47±5.85a CY 60 31.38±5.63c CY+FPCP 60+50 42.47±2.66b CY+FPCP 60+100 45.19±5.74ab

由表4可知，CY模型组小鼠巨噬细胞吞噬率较CK正常组明显降低，仅为CK组的62.18%，且差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，提示CY对小鼠巨噬细胞吞噬率有显著抑制作用，即环磷酰胺致小鼠免疫低下模型构建成功。高、低剂量的发酵茯苓多糖组小鼠吞噬细胞吞噬率分别为CY组的1.44倍与1.35倍，且与CY组均差异显著（P＜0.05），表明发酵茯苓多糖能有效提高环磷酰胺致免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬率。发酵茯苓多糖高剂量组巨噬细胞吞噬率与CK正常组无显著差异，为CK正常组的89.54%，表明高剂量发酵茯苓多糖能有效提高免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率。

3 结论与讨论

研究表明，给小鼠皮下注射环磷酰胺60mg/kg·BW，连续3次，可使小鼠脏器指数、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬细胞吞噬率明显下降，说明小鼠的免疫功能受到抑制，免疫低下模型构建成功，给免疫低下模型小鼠灌胃高低剂量（100、50 mg/kg·BW）发酵茯苓多糖，小鼠脏器指数、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬细胞吞噬率明显提高，且与环磷酰胺模型组差异显著，说明发酵茯苓多糖可显著缓解环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用。彭小彬等[12]研究报道了茯苓多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用，发现灌胃100 mg/kg·BW的茯苓多糖能有效提高小鼠血清溶血素水平及IgG与IgM含量，分别达到CK正常组的72.26%、96.53%、76.91%。本试验结果与该报道结果一致，且经黑曲霉发酵后的茯苓多糖对小鼠溶血素水平及IgG与IgM含量的提高作用强于该报道中未发酵的茯苓多糖。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其脏器指数可以在一定程度上反应机体免疫功能的强弱。胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与细胞免疫。脾脏中含有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，主要参与体液免疫[13]，表1结果显示，灌胃100 mg/kg BW剂量的发酵茯苓多糖能有效恢复免疫抑制小鼠的脏器指数，胸腺与脾脏指数分别达正常水平的87.62%、98.34%，表明发酵茯苓多糖有较好的增强免疫抑制小鼠的免疫调节作用。单核-巨噬细胞能对外来异物进行识别和清除，具有强大的吞噬杀伤作用，吞噬率可以反映机体非特异性免疫功能的强弱[14]，发酵茯苓多糖能显著增强免疫低下小鼠非特异性免疫调节功能。

自然界中的多糖多为混合物，具有单糖组成不同、结构差异明显的特性[15]。对多糖类物质的生物活性研究，既包括药物化学研究方面，从提取粗多糖（包括去除色素、游离蛋白、小分子杂质）到通过离子交换柱、大孔径树柱色谱层析法对不同多糖组分进行分离纯化的过程，也伴随着药效学研究方面，从粗多糖层次证实活性，到各分离纯化阶段对不同多糖组分进行活性追踪与筛选[16]。通过观察经黑曲发酵后茯苓多糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的免疫调节作用，初步提示发酵茯苓多糖在一定浓度范围，具有激活机体固有性和适应性免疫的生物活性，为进一步开展发酵茯苓多糖的生物活性与机制研究提供了研究基础。