基于MHC遗传标记的改则县本地牦牛与半野血牦牛群体遗传多样性评估

朱彦宾 平措占堆 洛桑顿珠

摘要    本研究利用MHC基因区域2个遗传标记（BF1和BM1258）对改则县的本地牦牛（GZD，16头）和半野血牦牛（GZY，18头）进行遗传多样性评估。结果表明，BF1位点的期望杂合度（HE=0.719 96）和多态信息含量（PIC=0.660 63）以及等位基因数（NA=11）都要高于BM1258位点（HE=0.567 73、PIC=0.455 53、NA=6），但BF1位点的观测杂合度（HO=0.303 31）小于BM1258位点（HO=0.664 71）。就群体而言，GZD的期望杂合度为0.672 7±0.093 4（HE±SD）、观测杂合度为0.556 3±0.089 2（HO±SD）以及PIC为0.585 34，均高于GZY。GZD的近交系数（FIS=0.178）小于GZY（FIS=0.337）。通过2个微卫星位点基因型共构建了17种单倍型，GZD中含有12种单倍型，GZY中存在11种单倍型。在单倍型水平上，GZD的期望杂合度（HE）为0.875 9，观测杂合度为0.800 0±0.103 3，多态信息含量为0.832 3，也略高于GZY相关参数。2个群体之间的遗传分化指数在2个水平差异不显著，FST=-0.013 70（位点水平），FST=-0.003 00（单倍型水平）。总体而言，2个牦牛群体的MHC免疫区域遗传多样性丰富，暗示其抗病性和适应性遗传基础优秀，2个群体遗传差异不明显，加之半野血牦牛种群近交系数偏高，故建议对2个群体采取混群合并保种，提高种畜利用率，防止近交系数持续增高。

关键词    牦牛;MHC;遗传多样性;西藏改则

中图分类号    S823         文獻标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）21-0209-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In this study，two genetic markers（BF1 and BM1258）of the MHC gene region were used to evaluate the genetic diversity of local yak（GZD，16 individuals）and semi-wild yak（GZY，18 individuals）in the Gaize County.The results showed that the expected heterozygosity（HE=0.719 96）and polymorphic information content（PIC=0.660 63）and allele number（NA=11）of BF1 locus were higher than BM1258 locus（HE=0.567 73，PIC=0.455 53，NA=6），but the observed heterozygosity of the BF1 locus（HO=0.303 31）was smaller than the BM1258 locus（HO=0.664 71）.In terms of population，the expected heterozygosity of GZD was 0.672 7±0.093 4（HE±SD），the observed heterozygosity was 0.556 3±0.089 2（HO±SD），and the PIC was 0.585 34，all of them in GZD were higher than GZY.The inbreeding coefficient of GZD（FIS=0.178） was smaller than GZY（FIS=0.337）.A total of 17 haplotypes were constructed by two MHC microsatellite loci，12 haplotypes in GZD and 11 haplotypes in GZY.At the haplotype level，the expected heterozygosity（HE） of GZD was 0.875 9，the observed heterozygosity was 0.800 0±0.103 3，and the polymorphic information content was 0.832 3，which was also slightly higher than the genetic differentiation index between the two populations of GZY related parameters.The two levels showed no significant difference，FST=-0.013 70（site level），FST=-0.003 00（haplotype level）.In general，the rich genetic diversity of the MHC immunization regions of the two yak popu-lations suggests that the genetic basis of disease resistance and adaptation is excellent，and the genetic difference between the two yak populations is not obvious，and the inbreeding coefficient of the semi-wild yak is high.In addition，we recommended the two populations were mixed and preserved to improve the utilization rate of the breeding stock and conflict to the inbreeding coefficient from increasing.

主要组织相容性复合体（major histocompatibility compl-ex，MHC）是一组编码动物主要组织相容性复合物基因群的统称。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC I类、MHC II类、MHC III类基因，分别编码MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子[1-2]。MHC区域参与免疫反应的编码受体基因含有高度的多态性。MHC的主要功能包括抗原递呈加工、细胞间相互作用、调控免疫应答、诱导免疫反应、抑制细胞活性等[3]。

目前，国内外已有很多学者研究MHC分子在不同物种中的遗传多样性。Wang等[4]在2017年研究了中国白鹭中的MHC I的遗传多样性。Gillingham等[5]对地中海地区的大火烈鸟的不同群体之间的MHC II B的遗传多样性进行了分析。Mishra等[6]在2019年研究了MHC在印度牦牛中的遗传多样性。陈李鹏[7]在2017年研究MHC在不同的山羊品种以及牛中的遗传多样性。张 栋等[8]研究了不同尼罗罗非鱼群体 MHC II A基因多态性和遗传分化。屠云洁等[9]对狼山鸡保种群不同世代MHC BF基因遗传多样性进行了研究。肖 衎等[10-11]对中华鲟野生群体及迁地群体的MHC Ia和MHC II B基因分别进行了遗传多样性分析。黄勋和等[12-14]研究了MH-CB区域复合微卫星位点LEI0258在麒麟鸡、华南家鸡和贵妃鸡中的遗传多样性。魏 磊等[15]研究了MHC基因在皖南黄牛和14个地方黄牛中遗传多样性，并进行了系统分析。岳远瑞等[16]对新疆7个绵羊品种MHC区段微卫星进行了遗传多样性分析。因此，MHC基因区域遗传标记已经被广泛的用于家养动物遗传多样性研究。

本研究对西藏阿里地区改则县半野血牦牛和当地家养动物牦牛群体，利用MHC区域遗传标记进行遗传多样性评估，以期对该地区2个牦牛群体的免疫遗传多样性进行鉴定的同时，对2个种群的结构差异程度进行评估，为当地半野血牦牛资源的保护与开发利用提供数据参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

系统内随机抽样选择西藏阿里地区改则县本地牦牛（GZD）16头和半野血牦牛（GZY）18头，共34头，采集静脉血，带回实验室，于-80 ℃的冰箱中保存备用。用提取试剂盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取全血基因组DNA，于-20 ℃保存。

1.2    试验访求

2对MHC引物信息。BF1：F为CAACGGTCTGCAACCG-AATTACC，R为CAATCCGTGGGTTGGAACACAA，退火温度为 58 ℃。BM1258：F为GTATGTATTTTTCCCACCCTGC，R为GTCAGACATGACTGAGCCTG。

采用20 μL反应体系，其中各组分的终浓度分别为dN-TPs 0.2 mmol/L、Mg2+ 1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、DNA模板1 μL（约60 ng）。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，经过35个循环;于72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。本研究的PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测分析;PCR产物用ABI 3130 xl全自动基因分析仪进行分型检测。

用Microsatellite Toolkit软件[17]计算各遗传位点的等位基因数（Number of alleles，NA）、多態信息含量（Polymorphic information content，PIC）、观察杂合度（Observed Heterozygos-ity，HO）和期望杂合度（Expected Heterozygosity，HE）等参数。用Arlequin 3.5软件[18]计算物种内群体间遗传分化指数（FST）并构建单倍型。用GENEPOP 3.4软件[19]进行哈德温伯格平衡检验（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）。用FSTAT 2.9软件[20]计算群体近交系数（FIS）。

2    结果与分析

2.1    2个位点的遗传多样性

由表1可知，从2个位点在2个牦牛群体中平均水平来看，BF1位点的期望杂合度（HE=0.719 96）、多肽信息含量（PIC=0.660 63）、等位基因数（NA=11）都要高于BM1258位点的HE值（0.567 73）、PIC值（0.455 53）、NA值（6）;BF1位点的观测杂合度HO值为0.303 31，低于BM1258位点（HO=0.664 71）。2个位点中，BF1位点的观望杂合度值小于其期测杂合度，而BM1258位点的期望杂合度却小于其观测杂合度。BF1位点在2个群体中均偏离了哈代温伯格平衡，而BM1258位点则均未偏离哈代温伯格平衡。这可能是由于不同座位所在区域基因功能差异所致，尤其是大量MHC区域编码基因与环境适应性和抗病免疫等诸多生物学作用相关，故而不同区域或基因座位受到不同选择的形式和选择程度存在差异。

2.2    2个牦牛群体的遗传多样性

由表2可知，改则县本地牦牛的期望杂合度（HE±SD为0.672 7±0.093 4）、观测杂合度（HO±SD为0.556 3±0.089 2）以及多态信息含量（PIC=0.585 340）均高于改则县半野血牦牛的期望杂合度（HE±SD为0.615 0±0.058 8）、观测杂合度（HO±SD为0.411 8±0.084 4）以及多态信息含量（PIC=0.530 822）。说明2个牦牛群体均呈现高度遗传多样性。同时，GZD的遗传多样性丰富程度较GZY略高，暗示可能由于GZY群体始祖群建立初期，纯种野牦牛血缘数量限制所致。

从近交系数来看，GZD的近交系数为0.178，较低于GZY的近交系数（FIS=0.337），说明本地牦牛的遗传多样性比半野血牦牛的保护情况稍好，但就FIS值来看，2个群体还是不同程度上存在近交的可能。其次，虽然2个群体中的平均等位基因数均为5.50±2.12，但部分低频率基因型种类仍存在一定程度差异，暗示了半野血群体内由于栖息地交叉而导致血缘交融，但仍然由于遗传背景差异使得部分种群特异遗传物质得以保留，同时也说明当地GZD牦牛群体并没有完全受到野牦牛及GZY牦牛的大规模血缘侵染。另外，2个群体之间的遗传分化指数（FST）为-0.013 70，卡方显著性检验显示二者种群遗传差异不显著（P>0.05）。

另外，剔除2个位点基因型缺失个体数据后，分别剩余牦牛GZD群体15头和GZY群体16头。利用2个MHC位点的片段长度基因型对这31头牦牛的MHC 2个位点进行单倍型的重构，单倍型的种类频率如表3所示。可以看出，2个群体共携带17种单倍型，其中GZD群体携带12种单倍型，GZY群体携带11 种单倍型;其中有6种高频率单倍型是GZD和GZY群体所共有的，GZD群体携带6种私有单倍型，每种单倍型的发现频数均为1;GZY群体独有单倍型数量为5种，频数均为1。最高频的为单倍型4（Haplotype-4），其总体频数为16，在GZD和GZY群体中频数分别为9和7。这个结果暗示了2个牦牛种群间存在大量遗传物质交换的可能，这与2个牦牛群体地理分布的交叉性是密不可分的。

利用单倍型对2个群体进行遗传多样性分析，结果如表4所示。可以看出，利用单倍型数据进行遗传多样性分析的结果与利用单个位点进行遗传多样性分析的结果相似。如GZD群体期望杂合度（HE±SD为0.875 9±0.000 0）、观测杂合度（HO±SD为0.800 0±0.103 3）、多态信息含量（PIC=0.832 3）高于GZY群体的期望杂合（HE±SD为0.869 0±0.000 0）、观测杂合度（HO±SD为0.687 5±0.115 9）、多态信息含量（PIC=0.823 7）。GZD群体的近交系数为0.089，低于GZY群体的近交系数（0.214）。在哈代温伯格检测中，2个群体中MHC单倍型都偏离了哈代温伯格平衡，2个群体间的群体遗传分化指数为-0.003 00，表明2个群体之间差异不显著。以上结果进一步暗示从MHC单倍型水平来看，2个群体的遗传结构相似。同时，MHC单倍型的高度多态和杂合度在一定程度上反映出2个地方牦牛种群具有极其丰富的免疫相关的MHC变异，这可能是由于当地自然群体受到人为选种选育压力低所致，最重要是可能与2个群体具有高度的环境适应性能力存在联系。

3    结论

本研究利用MHC区域遗传标记位点对西藏阿里地区改则县半野血牦牛及当地家养牦牛群体遗传多样性进行研究，结果发现2个群体免疫区域遗传多样性丰富，同时2个种群尽管存在一定特有MHC基因型和单倍型，但总体遗传差异不明显。另外，由于半野血牦牛群体近交系数较高，存在近交风险，故建议今后对2个群体进行混群保种，加大外源野牦牛血液渗透的同时，提高现有种群种畜利用率和参与度，以保障该地区牦牛资源群体的可持续发展利用。

4   参考文献

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