红花中5种成分的含量测定

吴 晶，杨怀镜，周 萍

(1.大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000；2.大理州食品药品检验所，云南 大理 671000)

红花(CarthamustinctoriusL.)又名次红花、红花草、红花菜、红蓝花等，为一种菊科植物的干燥管状花[1]，性温，味苦，具有通经、活血和止疼等功效[2-4]，为民间常用的活血化瘀药。现代药理学研究表明，红花具有抗炎、抗肿瘤、保护心血管、免疫力调节等作用[5-11]。根据文献报道红花中含有山奈素、槲皮素、羟基红花黄色素A、腺苷、没食子酸、原儿茶酸和金丝桃苷等多种化学成分。何婷等[12]采用HPLC法同时测定红花中羟基红花黄色素A、山奈素、槲皮素和芦丁的含量。红花中山奈素的测定需要盐酸水解，而芦丁水解产物有槲皮素和异槲皮苷等[13]，若同时测定山奈素需要将红花进行水解，对红花中芦丁及槲皮素含量有影响。本实验采用HPLC法同时测定云南不同产地红花样品中槲皮素、芦丁、原儿茶酸和羟基红花黄色素A的含量，对红花中多个指标成分进行分析，旨在为云南红花药材的质量控制提供参考。

1 实验仪器与材料

1.1 实验材料

本研究所用红花样品主要采集于云南大理和丽江2个城市的不同地方，共25批，均经大理白族自治州食品药品检验所杨怀镜主任药师鉴定为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，凭证标本放于大理白族自治州食品药品检验所标本室，样品自然阴干后粉碎，放入干燥容器中于室温下避光保存。样品信息见表1。

表1 红花样品信息

1.2 实验仪器

本研究所用试剂乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为实验室自制超纯水。本研究所用仪器见表2，样品信息见表3。

表2 仪器信息

表3 样品信息

2 试验方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、没食子酸、芦丁、原儿茶酸和羟基红花黄色素A对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到相应的对照品储备液。再量取上述对照品储备液各1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到槲皮素、没食子酸、芦丁、原儿茶酸、羟基红花黄色素A浓度分别为143.60、4.89、41.20、11.72、22.22 g·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定红花供试品粉末约0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入25%的甲醇溶液25 mL，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)40 min，冷却，再精密称定重量，用25%的甲醇补重，摇匀，滤过，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：采用波长切换(表4)；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液，柱温30 ℃，进样量5 μL，流速1.0 mL·min-1，梯度洗脱程序见表5。

表4 波长切换程序

表5 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验按“2.1”项下方法制备混合对照品溶液和红花S2样品的待测溶液，按“2.2”项下的液相色谱条件进行测定，得到HPLC图谱，混合对照品溶液和S2供试品溶液的色谱见图1和图2。

注：1-没食子酸；2-原儿茶酸；3-羟基红花黄色素A；4-芦丁；5-槲皮素

注：1-没食子酸；2-原儿茶酸；3-羟基红花黄色素A；4-芦丁；5-槲皮素

所得的图谱中没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、芦丁和槲皮素与供试品中其他组分分离效果良好，5种待测成分与其他成分均能达到基线分离，分离度均>1.5，理论塔板数均>5 000。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下方法制备的混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL于10 mL的容量瓶中，加25%的甲醇定容至刻度，混匀，即得系列混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件依次进样测定，以对照品的浓度X((g·mL-1)为横坐标，以其相应的峰面积Y为纵坐标绘制回归曲线，结果见表6，结果显示各组分线性关系均良好。

表6 回归方程、相关系数及线性范围

2.3.3 精密度试验 取“2.1”项下制备的混合对照品溶液连续进样6次，分别计算各成分6次进样峰面积的RSD值，结果没食子酸、HSYA、原儿茶酸、芦丁、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.10%、0.95%、1.35%、1.31%、1.33%，表明仪器的精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取S2红花粉末样品约0.2 g，平行称取6份，精密称定，按“2.1”项下的方法制备样品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，并记录，然后计算出5种成分含量的RSD值。没食子酸、HSYA、原儿茶酸、芦丁、槲皮素的平均含量为1.70 mg·g-1、894.44 mg·g-1、22.99 mg·g-1、37.23 mg·g-1、1.35 mg·g-1，RSD值分别为1.59%、1.58%、0.60%、1.24%、0.51%，表明实验建立的HPLC法同时测定5种成分的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取S2红花样品约0.2 g，精密称定，按“2.1”项下的方法制备样品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、16、24 h时，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，并记录相应的色谱图，计算5种成分峰面积的RSD值，没食子酸、羟基红花黄色素A、原儿茶酸、芦丁、槲皮素的RSD值分别为1.46%、0.24%、0.20%、1.22%、0.35%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的S2红花样品(没食子酸含量为1.73 mg·g-1，羟基红花黄色素A的含量为892.24 mg·g-1，原儿茶酸含量为23.97 mg·g-1，芦丁含量为36.34 mg·g-1，槲皮素含量为1.36 mg·g-1)约0.2 g，精密称定，平行称取9份，分为高、中、低三组，每组分别加入相应的没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、芦丁、槲皮素对照品，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样测定，记录并计算5种成分的加样回收率。见表7-表11。

表7 红花样品中没食子酸加样回收试验结果 (n=9)

表8 红花中羟基红花黄色素A加样回收试验结果 (n=9)

表9 红花中原儿茶酸加样回收试验结果 (n=9)

表10 红花中芦丁加样回收试验结果 (n=9)

表11 红花中槲皮素加样回收试验结果 (n=9)

2.4 含量测定

分别称取云南不同产地的红花粉末样品约0.2 g，精密称定，每批平行称取3份，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件测定，记录峰面积，按外标法计算供试品溶液中5种成分的含量，结果见表12。

表12 5种成分的含量测定结果 (n=3)

续表12 5种成分的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

实验考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同流动相梯度洗脱的分离效果，结果显示以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，5种成分色谱峰峰形较好，与供试品中其他成分分离较完全，故选择流动相甲醇-0.2%磷酸水溶液作为流动相。

实验考察了Waters Symmetry-C18、Waters XSELECETTMGSHTMC18、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱对供试品中待测组分与其他成分的分离度，结果显示，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱的分离效果较其他色谱柱更好，故选择Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。

实验也考察了流速(0.5、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、柱温(20、25、30、35 ℃)对分离效果的影响。结果显示，流速、柱温的变化仅引起色谱峰保留时间的改变，峰面积和峰型没有影响，综合考虑实际测定要求和色谱柱的使用寿命，选择流速 1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。

对于波长的选择，通过对5种成分混合对照品溶液进行分析，没食子酸和原儿茶酸在254 nm波长处有较大吸收，而羟基红花黄色素A、芦丁和槲皮素则在360 nm处均有吸收，故采用波长切换进行实验使色谱峰分离效果更好。

3.2 同时测定7种成分的考察

实验同时测定了没食子酸、羟基红花黄色素A、腺苷、金丝桃苷、原儿茶酸、芦丁和槲皮素7种成分的含量，所得结果中S1、S2、S4、S24、S25样品中腺苷含量为0.20 mg·g-1、0.17 mg·g-1、0.10 mg·g-1、0.25 mg·g-1、0.18 mg·g-1，其他批次样品中腺苷含量为0；金丝桃苷的测定结果S1、S8、S9、S15、S21、S24、S25含量分别为0.10 mg·g-1、0.072 mg·g-1、0.090 mg·g-1、0.093 mg·g-1、0.22 mg·g-1、0.80 mg·g-1、0.071 mg·g-1，其他批次样品中未检出金丝桃苷。结果表明云南红花中多个产地红花中无腺苷和金丝桃苷。张戈比较了不同品种红花中腺苷的含量，其中新疆吉木萨尔无刺红花含量最高，而塔城无刺红花、余姚红花、合肥红花、新乡红花、菏泽红花等未检出腺苷。

3.3 结果分析

25批云南不同产地红花样品中5种成分的含量存在一定的差异，可能不同产地土壤、环境、气候等多种条件对红花中多种有效成分有影响。

本研究初步建立了HPLC波长切换法同时测定红花药材中5种不同化学成分的含量，结果表明，本方法灵敏度较高，分离度好，重复性良好，适用于红花中没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素A、芦丁和槲皮素的含量测定。