油田含油污泥土壤降解与修复试验研究

郭鹏 李汉周 刘松林 林刚 纪燕娟 朱国强

1.中石化江苏油田分公司石油工程技术研究院 2.江苏省油气微生物技术工程研究中心 3.中石化江苏油田分公司采油一厂

含油污泥是在石油开采、油气集输、炼制加工及含油污水处理过程中产生的一种由原油、水、重金属和污泥组成的固体废弃物。根据统计数据，“十一五”末我国每年产生含油污泥总量超过500×104t，按排污标准计算费用，直接处理成本高达50亿元。含油污泥具有污泥数量大、费用高的特点[1]。污泥中除含有大量残留油类外，还含有蒽、酚类等有毒物质，寄生虫、病原菌以及Cr、Cu、Pb等重金属，多氯联苯、二噁英、放射性元素等有毒有害物质，若不加以处理，不仅污染环境，而且还造成资源浪费[2]。含油污泥黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分离困难，同时因含油污泥的来源不同，其性质差别较大，因而具有处理难的特点[3-4]。

相对于物理和化学处理技术，含油污泥生物处理技术的优点是操作方便，处理成本低，作用持久，无二次污染，已在国外得到商业化应用[5]。特定微生物对含油污泥中的石油和有机物有很强的降解能力，最终可转化成无害的CO2、H2O等[6]。同时，处理过程中能够增加土壤腐殖质含量，其处理方式包括堆肥处理法、土壤耕作法、微生物降解法等[7-8]。MISHRA等[6]采用原位生物修复技术研究了微生物对炼油厂含油污泥的处理能力，加入培养好的菌种与营养物质120天后，油含量(原最高为99.2 g/kg)降低了90.2%；欧阳威等[9]采用微生物菌剂强化和堆制强化技术对油含量为 12.68%的污泥进行处理，56 天后，油含量降至6.42%。GC-MS 分析得出，微生物菌剂强化分解仅对碳原子数小于21的直链烷烃有着良好的降解效果，因而该技术存在难以选择到合适的菌种，处理周期长，对环烷烃、芳烃类等非直链烷烃处理效果差，对油田含油污泥难适应等问题[10-12]。

1 材料与方法

1.1 材料

离心管、塑料袋、取样铲、保温盒；LB培养基：胰化蛋白胨10 g(Bact-tryptone;Qbiogene 进口)、酵母膏5 g(yeast extract；Qbiogene 进口)、NaCl 10 g、琼脂18 g、Tris-HCl (Premega 进口)、EDTA-Na2(Premega进口)、β-巯基乙醇 (FLUKA进口)、氯仿(FLUKA进口)、异戊醇(FLUKA进口)。

-80 ℃超低温冰箱、制冰机、高压蒸汽灭菌锅(Tony)、超净操作台、培养箱、高倍显微镜、生物显微镜、高速冷冻离心机、751型分光光度计、恒温水浴、核酸电泳设备。

采集江苏油田站点含油污泥及污水。样品置于已灭菌、密闭的离心管中，密封保藏于低温容器内。

1.2 方法

1.2.1菌株的富集、分离纯化

称取5 g含油污泥或5 mL污水水样，加入装有100 mL富集培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min的恒温摇床条件下培养，5天后吸取5 mL培养液转接至新鲜培养基，相同条件培养5天。如此连续富集培养25天.培养液经稀释后涂布在固体PDA培养基上，于28 ℃培养。

待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落，采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌株的纯培养物，纯化后的菌株保存于培养基斜面。

1.2.2菌株的筛选

(1)初筛。将纯化的菌株分别接种到装有100 mL降解用液体培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min下培养5天，将培养液稀释适当倍数后涂布在相应的固体培养基上，观察各菌株在固体培养基中的生长情况，筛选出生长较快、菌落较多的菌株并镜检观察菌株形态。

(2)复筛。挑取各菌株的单菌落分别接种到装有50 mL液体牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒温摇床中培养24 h，测定菌液在600 nm处的吸光度，用灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基调节其质量浓度，使光密度(optical density,OD)600 nm约为0.4，以此稀释的菌液作种子接种筛选培养基。

(3)评价。吸取5 mL准备好的种子液接种到装有100 mL筛选培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒温摇床中培养4天后测定石油含量。每次单菌落评价做3次重复试验，根据3次试验的平均除油率，筛选得到除油率较高的菌株。

(4)分子生物学鉴定。设计16S rDNA 通用引物(Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer B：5’-GCTACCTTGTTACGACTT-3’)，以分离筛选菌株DNA为模板，采用菌落PCR方法进行16S rDNA 序列扩增。PCR反应体系(50 μL)：ddH2O 34 μL、10×buffer 5 μL、5 μL Mg2+、dNTP 2.5 μL、rTaq 0.5 μL、Primer A与Primer B各1 μL、模板DNA 1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环33次；72 ℃总延伸5 min。PCR产物连接克隆载体pEASY-T3并转化大肠杆菌Top-10中，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序的16S rDNA序列与已登录Genbank数据库的基因片段进行blast比对，并利用MEGA 5.0软件比较同源性和构建系统发育树。

2 降解试验与讨论

2.1 污泥组成

由于油田含油污泥本身的非均相特点，在不同站点及同一站点不同位置的污泥，其形状差异较大。现场采集站点2中3#样品，测试污泥组成，油泥两项组分中油质量分数为20.4%。污泥组成及干污泥中重金属含量见表1。

表1 站点2中3#样品原始污泥组成Table 1 Composition of raw sludge in sample 3#组分质量分数/%组分质量分数/(mg·kg-1)油2.3硼122.1水89.0镍33.6油水不溶物9.0汞0.4铅32.6砷11.4铬45.7

2.2 菌株筛选

使用上述初筛方法，观察各菌株在固体培养基中的生长情况，筛选出生长较快、菌落较多的菌株并镜检观察菌株形态。根据菌株特性及生长繁殖速度，初步筛选得到12株菌，显微形态见图1。

使用上述复筛方法，筛选出除油率较高的4株菌株，代号分别为Yn-33、Yn-1、Yn-5、Yn-3。

将复筛得到的菌株接种到含原油(质量浓度为85 mg/L)的无机盐培养基中，200 r/min摇床培养7天，利用紫外分光光度计测定残余油吸光度值，通过标准曲线换算出残余油的质量浓度，计算筛选菌株对原油的除油率，实验结果见图2。

结果表明，Yn-1和Yn-3培养7天后的除油率分别为22.7%和20.9%，相对于其他具有较好活性的菌株，具有更强的原油降解效率，说明分离筛选的石油烃降解菌株Yn-1和Yn-3对石油烃具有较高活性和适应性，能有效降解培养基中原油物质。进一步改善菌株的降解环境条件，提高菌剂降解效率为技术工艺的重点。

采用分子生物学鉴定方法，判定菌株Yn-1和Yn-3分别为短芽孢杆菌(Bacillus brevis)和赖氨酸芽孢杆菌(Bacillus lysine)。

2.3 菌种制备

将筛选出的石油烃降解菌株接种在筛选配方固体培养基的方形瓶中，25 ℃静置培养3～4天，形成细菌芽胞以制备菌种。无菌条件制备孢子悬浮液，经70～75 ℃水浴10～15 min，获得发芽势强、发育一致的孢子悬浮液，作为发酵菌种用于接种培养及小试试验。

2.4 生物活化剂的筛选

油田含油污泥中水含量、油含量较高(见图3)。油田含油污泥一般黏度大、乳化程度高，油、泥、水三相分离困难，使得油田含油污泥的生物降解过程难度较大。改善生物降解环境是提高生物降解效率的重要途径，在原始污泥中投加生物活化剂是重要手段之一。以站点2中3#样品为对象，试验中考察污泥在不投加菌剂而单纯投加不同生物活化剂条件下的对油泥团粒结构影响及其对相同菌株生物降解最终效果的影响，优选生物活化剂。

将定量油泥与定量的麦麸等4种生物活化剂(代号分别为E-M、E-D、E-T、E-G)混合后，置于25 ℃干燥箱中使水分自然蒸发，待水分蒸发至小于10%时，取出样品，采样，使用筛分法进行分级试验，分析处理油泥土样团粒结构组成。

由图4可见，油泥中添加不同活化剂成分后，油泥团粒结构有较大变化。4种生物活化剂中以E-G对油泥团粒结构影响最大，处理油泥团粒中大粒级(>5 mm、3～5 mm、1～3 mm)达21.1%，其次为E-D和E-M。采集站点2中3#含油污泥样品，分别配制包含上述4种生物活化剂和相同菌剂的污泥生物反应系统，混合后置于小试装置中，在菌剂与生物活化剂共同作用下，进行20天生物降解试验，过程中污泥外观性状变化，如图5所示。

测试对比经不同生物活化剂体系处理的污泥除油效果，结果见图6。从污泥除油率的变化上看，生物活化剂的投加显著增强了油泥中石油烃的降解效果。其中，采用E-G生物活化剂体系菌剂的除油效果最好，培养箱处理20天后，除油率达85.21%；E-T、E-D体系处理的，除油率分别为83.72%、82.21%，对照样品CK，其除油率仅13.58%。

2.5 试验装置与流程

为评价开发的菌株对于污泥中石油烃降解效果及其影响因素，评价生物活化剂体系对其他不同站点污泥的除油效果，设计开发了小试装置。该装置由生物反应、供气、记录等几个单元组成，每批次可独立进行3个箱体生物降解试验，试验中每个箱体中可填充10 kg污泥(见图7)。

试验中，分别采集不同站点的原生含油污泥，在定量污泥中依次投加不同的污泥生物活化剂、Yn-1和Yn-3菌剂等物料，均质后，置于图7所示的试验装置中，开展含油污泥生物降解试验，周期性记录降解过程中温度等参数的变化，试验结束后取样测试污泥中残余油含量，评价除油效果。

2.6 降解试验与降解效果

按照上述实验结果，选择E-G生物活化剂体系，采集现场不同站点的含油污泥，将生物降解菌、活化剂等按比例和油泥混拌均匀后，置于小试试验装置中，按照第2.3节所述实验方法与流程，进行生物降解试验。

试验过程中保持污泥温度为20～35 ℃，培养20天后，取样测定处理油泥内部微生物数量，并检测油泥除油率，数据如表2所列。

表2 生物活化剂及菌剂对不同站点污泥的降解效果Table 2 Degradation effect of biological activator and microbial agent on sludge at different sites污泥样品来源w(原始污泥油)/%,干基w(处理后污泥油)/%,干基除油率/%平均除油率/%站点140.738.7178.61站点220.493.0385.21站点329.835.1682.70站点451.5210.6679.3081.46

表2数据表明：采用生物活化剂及菌剂处理，经过20天生物降解，各站点污泥平均除油率81.46%；对于油含量相对较低的污泥(油含量20.49%)，除油率为85.21%。

3 修复试验与讨论

3.1 植物与微生物体系对降解油泥的修复

油泥经微生物降解后仍具有一定的生物毒性，利用特性植物可以修复和消除由有机毒物和无机废物造成的土壤环境污染。植物在生长过程中可直接或间接地吸收、分离或降解有机污染物，从而起到消除有机污染的作用。同时，植物生长与土壤微生物存在密切的关系，植物生长过程中根际的微生物也可和植物协同降解或固化有机污染物，植物与微生物的协同作用能明显提高修复效果。

试验过程中，选择站点2中3#原始油质量分数20%(干重)经过降解处理后油质量分数为2%～5%的污泥土壤作为修复试验对象。

修复过程不仅有利于促进植物克服油泥土壤毒性完成适生性生殖，同时还能优化土壤微生物类群，有助于促进石油烃降解菌的活性发挥，增强植物-微生物的综合降解效能。

3.1.1植物-微生物修复体系中适生植物的生长情况

通过豆科、禾本科等9种不同类型植物品种，开展适生性筛选试验。

结果表明(见表3)，油泥土对多种筛选植物具有普遍生物毒性，但不同植物适应程度不同。豆科植物的黄豆、黑豆、绿豆适生性较弱，其中绿豆在油泥土中具有一定的适生性，但其在降解油泥中不能生根，绿豆在油泥土中虽能生长发芽，但生长受到显著抑制；禾本科的BB、AA、CC等植物的适生性较强，在降解油泥及优化的油泥土中都能生根、发芽及生长，其中以BB、AA适生性较强。

双子叶植物筛选发现，十字花科的植物对油泥生物毒性最为敏感，在油泥土、降解油泥中均不能生根、发芽和生长，可以作为生物毒性的指示植物。

而植物CC却具有较强的耐受能力，在降解油泥和优化的油泥土中均能生根、发芽和生长。因此，选择AA、BB、CC 3种植物作为降解油泥的种植修复植物。

表3 不同植物在降解油泥及优化油泥土中的适生性筛选Table 3 Suitability screening of different plants in degrading oil sludge and optimizing oil sludge植物降解油泥油泥土生根发芽生长适生性生根发芽生长适生性DD++--+++++黄豆-----++-黑豆-----++-绿豆-+---+++苜蓿++--+++-AA++++++++++++++茼蒿-----+--CC+++++++++++BB++++++++++++++ 注: +表示适生程度,-表示抑制程度。

3.1.2不同修复体系和修复周期对石油烃降解效果分析

以标准原油为试样绘制标准曲线，得到原油含量与吸光度的回归方程：y=0.0434x+0.0005(R2=0.9946)，如图8所示。

测定3种修复体系中第1次种植(30天)的油泥土原油含量从3.81%下降解到1.65%～2.33%，其中以AA体系降解效率最高。第2次种植后原油含量进一步降低，降解效率最高为AA-促生菌体系，原油质量分数降至1.41%，如表4所列。

表4 不同修复周期油泥中含油率测定Table 4 Determination of oil content in oil sludge in different repair periods含油率/%处理第1次种植第2次种植BB体系2.061.55AA体系1.651.41CC体系2.331.62平均值2.051.56

4 结论

(1)利用分子生物学技术手段，在油田污水污泥中筛选出2种石油烃降解菌Yn-1和Yn-3，分别为短芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌，除油率分别达到22.7%和20.9%。

(2)开发的生物活化剂改善了原始污泥的物理性状，增强了菌剂降解活性，通过20天强制生物降解处理后的污泥，平均除油率达到81.46%。

(3)对于w(含油)<20%的油田含油污泥，采用生物降解后，再经过两个周期的植物与微生物修复，污泥w(含油)<2%，油含量达到SY/T 7301-2016《陆上石油天然气开采含油污泥资源化综合利用及污染控制技术要求》的指标要求，满足井场道路铺设用土要求。