犬干扰素的中试生产工艺及临床前研究

赵明 蒋贻海 魏波 曲信芹

犬干扰素的中试生产工艺及临床前研究

赵明①蒋贻海③魏波②曲信芹③

（①青岛蔚蓝生物制品有限公司 山东 青岛 266114 ②青岛动保国家工程技术研究中心有限公司 山东 青岛 ③青岛蔚蓝生物股份有限公司 山东 青岛）

为了探索基因工程重组犬干扰素500L发酵罐中试规模生产工艺的建立以及犬干扰素的临床评价而进行了研究；结果表明，中试生产得到的犬干扰素纯度为98.4%，比活性为2.97×106U/mg，内毒素含量为19IU/ml，符合产业化要求。

重组犬干扰素 中试 生产工艺

干扰素(INF)是由Isasscs等在进行鸡胚细胞流感病毒感染试验中首次发现的一类能干扰和抑制病毒复制的可溶性细胞分泌物,并将其命名为干扰素(interferon,INF)。干扰素是一种多功能的细胞因子家族中的一员,由干扰素诱生剂作用于细胞膜后,可使细胞产生一种特异因子,这种因子和细胞DNA中的干扰素基因抑制物结合,解除了干扰素基因的抑制作用,从而合成干扰素。干扰素作用的发挥是一个复杂的过程，通过 “INF系统”来实现,表现出一定的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗细菌和寄生虫等作用。随着人们对宠物疫病防治的关注，有效预防和治疗宠物病毒性疾病成为研究的重点。Hiummler等(1987)首先对犬的INF-α基因进行了研究，并报道了犬INF-α基因序列。Devos K等(1992)克隆了犬INF-r基因，杨琪等(2002)克隆了犬INF-r cDNA，并用PRC/CMV2表达载体率先在鼠骨髓瘤细胞中进行表达,张海峰等(2005)实现了重组犬INF-r在大肠杆菌中的高效表达。犬干扰素无论是天然的还是重组的干扰素均具有较强的抗病毒能力，临床上已经将重组的犬干扰素应用于防治狂犬病、犬细小病毒病、犬瘟热、犬病毒性肝炎等病毒病。

本研究将本公司构建完成的基因工程重组犬干扰素pBV220-caIFN/ BL21(DE3)菌种，在前期完成的实验室制备工艺的基础上进行中试放大，按照GMP的相关要求进行试制，得到的犬干扰素纯度为98.4%，比活性为2.97×106U/mg，内毒素含量为19EU/ml，适合产业化要求。

1 材料与方法:

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞株及毒株 pBV220-caIFN/ BL21(DE3)、MDCK细胞(犬肾细胞)，VSV(水泡性口炎病毒)均为本实验室保存。

1.1.2 仪器设备 生化培养箱、恒温震荡培养箱、500L发酵罐、管式离心机、大容量高速冷冻离心机、高压匀浆细胞破碎仪、蛋白质电泳仪、磁力搅拌器、超滤浓缩装置、BIAO-RAD BioLogic LP层析系统、恒温水浴锅、酶标仪

1.1.3 试剂耗材 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、硫酸铵、咪唑、鲎试剂检测试剂盒、Brandford法蛋白浓度检测试剂盒、

1.2 方法

1.2.1 中试制备 将保存的冻干pBV220-caIFN/BL21(DE3)菌种，用无菌水混悬后，转移至试管中37℃ 200rpm恒温震荡培养4h后划线接种于LB Amp平板，37℃于生化培养箱中孵育过夜；挑单菌接种于5ml LB Amp培养基中37℃ 200rpm恒温震荡培养过夜作为一级种子；将活化好的pBV220-caIFN/ BL21(DE3)菌种转接于3L LB Amp培养基中37℃ 200rpm恒温震荡培养过夜作为二级种子；将培养好的二级种子，1%接种于300L灭菌培养基的发酵罐中30℃发酵培养至OD为0.6~0.8时提高温度至42℃进行诱导表达，继续培养5~6h后停止发酵培养。

1.2.2 菌体回收 用管式离心机12000g 100L/h离心收集菌体后用10倍体积生理盐水混悬菌体，菌悬液用大容量高速冷冻离心机4℃ 7000rpm 15min离心收集菌泥，保存于-20℃中备用。

1.2.3 菌体破碎 将保存好的菌泥用10倍体积的PBS混悬，于磁力搅拌器上搅拌均匀后，用高压匀浆细胞破碎仪4℃, 800-1000 Bar, 10L/h破碎三次后用大容量高速冷冻离心机4℃ 7000rpm 15min离心收集沉淀。

1.2.4 纯化分离 将沉淀用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，5mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris·HCl，10 mmol/L DTT，150mmol/L NaCl，pH9.0)溶解沉淀，4℃条件下，8000rpm 15min收集上清得到变性蛋白溶液，将变性蛋白溶液缓慢滴加到复性缓冲液(0.5mol/L L-Arg；2mmol/L EDTA，15%甘油；0.9mmol/L GSSG，50mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0)中，4℃静置48h，4℃条件下，8000rpm 15min收集上清，即为含有重组蛋白的溶液。将重组蛋白溶液加入等体积的饱和硫酸铵溶液于磁力搅拌器上搅拌均匀后室温静置沉降过夜，用大容量高速冷冻离心机4℃，9000 rpm，15min离心收集沉淀，沉淀用9倍体积的PBS混悬并加入1倍体积的饱和硫酸铵溶液于磁力搅拌器上搅拌均匀后室温静置沉降过夜后用大容量高速冷冻离心机4℃，7000rpm，15min离心收集上清；上清用0.45um的圆片膜过滤澄清后，5KD膜包超滤浓缩10倍后用PBS洗滤4次。所得浓缩液0.22um的圆片膜过滤澄清后用装有chelating sepharose fastflow的XK26/20层析柱于BIAO-RAD BioLogic LP层析系统进行分离纯化，纯化所得样品用5KDA膜包超滤用PBS洗滤4次并0.22um除菌过滤后得到半成品。

1.2.5 半成品检验 按照生物制品规程进行无菌检验和内毒素含量测定、总蛋白浓度测定、蛋白纯度分析、犬干扰素α抗病毒比活性测定、用Western-BLOT法检测特异性。并进行小鼠安全性试验、实验室犬安全性试验及实验室犬有效性试验。

2 试验结果

2.1 发酵培养

表达结果SDS-PAGE分析见图1。

2.2 无菌检验实验结果

根据《中华人民共和国曾药典》，供试品在25℃和相对湿度60%±10%条件下抽样检测无细菌污染。

图1 重组大肠杆菌表达形式鉴定

M：蛋白Marker；1：未诱导全菌；2：诱导全菌 3：裂解上清；4：沉淀

图2 重组大肠杆菌表达产物特异性分析结果

M：蛋白Marker；1：未诱导对照；2：复性液

2.3 内毒素含量测定

根据《中华人民共和国兽药典》，供试品在25℃和相对湿度60%±10%条件下抽样检测内毒素含量均低于20IU/ml，为19IU/ml。

2.4 总蛋白浓度、纯度测定

根据《中华人民共和国兽药典》，干扰素半成品用Bradford法测定总蛋白浓度为0.21mg/ml，SDS-PAGE分析后灰度扫描犬干扰素纯度为98.4%。

2.5 犬干扰素α抗病毒比活性测定

参考Wish-VSV检测方法和微量细胞病变抑制法，建立MDCK-VSV体系测定重组犬干扰素α抗病毒比活性，细胞系是MDCK细胞(犬肾细胞)，病毒用VSV(水泡性口炎病毒)。测定方法用以细胞病变(CPE)抑制为基础的抑制微量测定法。用含有10% FBS的DMEM细胞培养基将细胞接种于96孔板中，于5%CO2，37℃培养至单层。将干扰素样品预稀释1000倍，再按4倍梯度稀释，每个梯度重复两孔。按每孔100ul接入。18h后，换入用不含FBS的DMEM培养基稀释的100TCID50病毒液，同时设置不加干扰素的病毒对照组和不加干扰素及病毒的细胞对照组，待病毒对照组出现90%以上细胞病变时，进行结晶紫染色，用酶标仪(Thermo，MultiSkan FC)在570nm波长读值。结果根据Reed-Muench法计算，活性为6.3×105U，比活性为2.97×106U/mg。

2.6 Western-BLOT特异性分析

取复性液进行Western-blot，结果在预期大小处约23kD出现目的条带，能特异性地被干扰素抗体识别，呈阳性(详见图2)。

2.7 小鼠安全性试验

将30只昆明系小鼠分为3组每组10只，分为对照组、单倍剂量实验组和10倍剂量实验组分别注射犬干扰素后观察14d，全部健活无异常。

2.8 实验室犬安全性试验

将15只比格犬分为3组每组5只，分为对照组、单倍剂量实验组和10倍剂量实验组分别注射犬干扰素后观察14d，全部健活无异常。

2.9 实验室犬有效性试验

将15只比格犬(50~70日龄)分为3组每组5只，分为空白对照组、攻毒组和实验组分别攻毒(剂量为1×107TCID50/只)待其出现明显的临床症状时用经过上述细胞病变法检测含有高生物学活性的重组犬α干扰素(重组犬α干扰素按40万IU/kg体重)进行治疗，结果表明犬治愈率增加，死亡率降低。

3 讨论

（1）现在动物干扰素在兽医临床应用尚处于初级阶段，通常用于紧急治疗传染性病毒病。在临床应用研究方面，国内外主要研究方向为，提高表达量和比活性、延长体内代谢半衰期、常温保存技术、扩大临床适用症范围以及蛋白质空间结构和改构等。随着犬类动物在国人生活中的伴侣作用越来越重要，加速研发适用于临床应用于多种犬类的干扰素生物制剂，更好的预防和治疗犬类疾病越来越重要。因为动物干扰素直接生产成本高、效率低、种属差异大、稳定性差等原因，利用基因工程技术大批量生产高纯高效干扰素是大多数研究者的首选方法，国内研究主要集中在大肠杆菌和酵母等表达系统方面，建立一个制备基因工程重组犬干扰素高纯高效的生产工艺，不仅仅可以获得巨大的经济效益，而且具有深刻的社会效益。（2）本研究利用前期构建好的基因工程重组犬干扰素表达菌株，在前期完成的实验室制备工艺的基础上进行中试放大，按照GMP的相关要求进行试制。本工艺采用大规模发酵培养技术发酵培养得到表达犬α干扰素的菌体，经过离心回收、洗涤后采用高压匀浆的方式裂解菌体；将收集的包涵体通过变性复性得到的重组犬干扰素，通过盐析、超滤浓缩、层析纯化、超滤脱盐和除菌过滤得到]=P8I7U5TR犬α干扰素半成品。整套工艺重复性好、操作简便、质量稳定，易于大规模成产，得到的基因工程重组犬α干扰素纯度为98.4%，比活性为2.97× 106U/mg，内毒素含量为19EU/ml，适合产业化要求。按照兽用生物制品规程的要求，本文通过进行无菌检验和内毒素含量测定、总蛋白浓度测定、蛋白纯度分析、犬干扰素α抗病毒比活性测定、用Western-BLOT法检测特异性，并进行了小鼠安全性试验、实验室犬安全性试验及实验室犬有效性试验，结果表明基因工程重组犬α干扰素，在小鼠和比格犬上的单剂量和超剂量安全性良好，无不良反应；在犬细小病毒病治疗试验中显示治愈率明显增加，死亡率明显降低。

本研究表明该基因工程重组犬干扰素已经具备临床研究的基础，并具备大规模产业化商业开发的可能。

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（2019–10–01）

十三五国家重点研发计划项目(2016YFD0501006) ；山东半岛国家自创区发展建设基金项目

S852.4+4

A

1007-1733(2019)12-0012-03