绿色木霉对生物降解和生物防治的影响机理与应用研究进展

贺 超， 王文全 ,2*， 侯俊玲

(1.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；3.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102)

随着我国农业的迅速发展，在保证国家粮食安全和社会稳定的同时，农作物秸秆生产量也在逐年增加，我国为农业大国，拥有丰富的纤维素资源，每年农作物秸秆产量达5.7×108t[1]；加之我国中药企业每年要消耗植物类药材数百万吨，随之产生的植物类药渣多达几千万吨(含水分)[2]。

目前此部分资源尚未得到充分开发利用，多被自然腐败或用于畜牧饲料、积肥与燃料，不仅占用大量土地，而且造成环境的严重污染和资源的巨大浪费。因此，对农作物秸秆、中药药渣进行合理利用不仅能减少资源浪费，提高利用率，改善生态环境，同时对植物健康生长和农业发展具有重要意义。木霉属(TrichodermaPers.)真菌因其在生物降解和生物防治[3-5]等方面的应用潜力，在农业生产领域具有特殊地位，而绿色木霉(Trichodermaviride)具有菌体生长量大且迅速、酶系齐全、产酶量大、酶活性高、降解木质纤维素能力强、绿色高效，以及自身生长营养要求简单、发酵过程中既有固态发酵方式也有液体深层培养方式等优点，被广泛应用于发酵工程和生物降解等相关领域[6-7]。同时，绿色木霉也是一种农业上常见生防菌，在抑制病原菌、促进植物生长、提高土壤肥力等方面具有广阔的应用前景[8-9]。基于此，本文就近年来国内外有关绿色木霉在生物降解和生物防治方面的功能和机制进行综述，同时对绿色木霉在资源节约型和环境友好型生态农业中未来应用前景进行展望。

1 绿色木霉生物降解功能

绿色木霉在代谢过程中会分泌大量胞外降解酶类，如纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶以及木聚糖酶等，用于降解农作物秸秆、中药药渣等环境中的有机物质，为自身生长、繁殖提供碳源和氮源。其中，绿色木霉在适宜条件下高产高活性纤维素酶系倍受关注，科研人员利用绿色木霉高产纤维素酶、降解能力强的特性，解决了沼气发酵前期好氧菌快速消耗易利用物质，导致厌氧菌缺乏养分供给问题；有机废物经绿色木霉有氧预培养后，被降解为容易吸收利用的物质，厌氧消化过程中甲烷产量明显增加[10]。有研究发现，绿色木霉突变菌株发酵液中纤维素水解酶活性显著提高[11]。目前，该领域研究主要集中在利用绿色木霉高产纤维素酶过程中发酵基质和条件优化，为充分利用可再生资源提供有效途径[12-13]。

纤维素是地球上数量最大的可再生资源，在自然界广泛分布，但目前利用率较低。纤维素酶是一种复合水解酶类，主要由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成。研究表明，绿色木霉是产纤维素酶系齐全、比例适当，且酶活力最高的菌株之一，能够有效降解纤维素类物质[14]。绿色木霉产生的纤维素酶可将植物纤维素水解为葡萄糖，破坏植物细胞壁，使其释放蛋白体、淀粉等营养成分，从而消除植物残渣中淀粉多糖的抗营养作用，提高植物残渣利用率[10]。若能合理加以开发利用，则能在一定程度上缓解能源危机、减少环境污染，并产生巨大的经济效益和生态效益。

绿色木霉可以通过产生纤维素酶将废报纸中的纤维素降解为可发酵的糖，并能高效降解造纸污水中的木质素，有利于减少环境污染，促进资源再利用[15]。用绿色木霉、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、烟曲霉(Aspergillusfunigatus)分别对甘蔗渣进行生物预处理，以还原糖增长量衡量三种高产纤维素酶菌株降解能力的强弱，结果发现绿色木霉组和烟曲霉组还原糖产量显著高于枯草芽胞杆菌组，说明绿色木霉和烟曲霉降解能力相对更强[16]。Korenaga等[17]研究表明，绿色木霉产生的纤维素酶对纤维素具有糖化作用，在最佳发酵条件下，绿色木霉纤维素水解酶的产量和活性显著提高，使稻草纤维素转化为葡萄糖的效率大幅提升。在对城市固体垃圾降解菌的筛选过程中发现绿色木霉组的降解效果最为显著，降解60 d后，堆肥垃圾减重33.35%[18]。Ghorbani等[19]发现，利用绿色木霉产纤维素酶降解水稻秸秆，能够明显提高秸秆纤维素降解率，大幅度提高其转化为还原糖的效率。对绿色木霉降解壳聚糖的研究发现，在温度50 ℃，pH 5.6，反应时间6 h时，其分泌的纤维素酶对壳聚糖有较高降解能力，而且酶解法反应条件温和，耗能低，中间产物壳寡糖稳定，具有良好的应用价值[20]。Surendra等[21]研究发现绿色木霉和黑曲霉显示出很高的纤维素酶活性，其中绿色木霉更能有效降解纤维素，提高蛋白质含量，这对于绿色木霉降解城市固体废物是一种有效途径。

大量研究表明，相比单一菌种发酵，多菌种联合作用效果更好[22]。以绿色木霉、黑曲霉、热带假丝酵母(Candidatropicalis)对啤酒糟进行联合固体发酵结果表明，当黑曲霉∶绿色木霉∶酵母=2∶1∶1、温度29 ℃、转速200 r/min条件下发酵5 d时，啤酒糟中纤维素、半纤维素含量显著下降，产物中蛋白含量可提高11.8%[23]。田亚红等[24]对多菌种混合发酵向日葵花盘、秸秆生产生物蛋白饲料进行了尝试，结果表明当啤酒酵母、枯草芽胞杆菌、绿色木霉接种比例为2∶2∶1时，混合有机物中大分子碳水化合物被大量降解为利于牛羊等牲畜消化吸收的小分子化合物，同时发酵产物中粗蛋白增加率为92.62%，发酵效果显著。肖洪等[25]发现黑曲霉(Aspergillusniger)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)与绿色木霉的比例不同会影响桑叶茶发酵产物中活性成分含量，在黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=2∶1∶2时，桑叶茶中主要功能性成分脱氧野尻霉素(DNJ)产量最高，脱氧野尻霉素是强效α-葡萄糖苷酶抑制剂，可有效抑制人体糖分转化，降低血液糖含量。利用绿色木霉高效降解能力，使其和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合发酵降解稻草中的纤维素，绿色木霉降解稻草纤维素产生的葡萄糖为酿酒酵母提供了良好碳源，其产物可再生能源乙醇含量显著提高[26]。此外，绿色木霉∶红芝=1∶4、接种量35%、发酵时间8 d；二次发酵酵母接种量7%、发酵时间24 h时，稻草秸秆发酵培养基中纤维素、半纤维素、木质素降解率显著提高[27]。

研究表明，绿色木霉对环境适应范围广，并对除草剂草甘膦具有良好的生物降解作用，因而具备修复因草甘膦大量使用导致土壤污染的能力[13]。研究者对印度尼西亚草甘膦严重污染土壤进行了野外修复试验，结果表明绿色木霉在自然条件下能显著降低由于草甘膦大量使用而导致的土壤pH升高，实现了对污染土壤的生物修复[28]。此外，绿色木霉对多环芳烃[29]、有机氯[30]等有机污染物也有良好降解效果。

近年来关于绿色木霉降解功能的应用研究报道相对较多，且多集中在对工农业废料、残渣的降解和再利用，如绿色木霉降解花生壳制备膳食纤维[31]，降解落叶及草坪碎屑缩短堆肥周期[32]，降解甘草渣产糖条件的研究[33]等。

2 绿色木霉生防和促生功能

生物防治是指利用对植物无害或伤害小的生物来抑制病原菌的生存和活动，以达到降低病害发生率或严重度的防治手段。绿色木霉作为一种分布广泛、生长迅速、能产生拮抗物质和寄生植物病原菌的真菌，已被广泛应用于植物病害尤其是植物土传病害的生物防治[34-35]。

2.1 绿色木霉对病原微生物的抗性

绿色木霉是一种广谱性强的拮抗微生物，广泛定殖在植物根、茎、叶中，对病原菌具有强烈抑制性并能显著提高植物抗病性，其作用机制主要包括竞争、溶菌、重寄生、产抗生素和诱导抗性等[36-37]。

绿色木霉对多种病原菌有重寄生作用，能够有效竞争营养物质和生存空间。大多数真菌细胞壁主要由几丁质、β-1,3-葡聚糖以及少量蛋白质和脂肪构成，绿色木霉菌体分泌大量几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等细胞壁降解酶，侵入寄主菌丝细胞吸食其营养物质[37]。覃柳燕等[38]研究发现绿色木霉对根腐病菌茄腐镰孢菌(Fusariumsolani)有显著拮抗效应。提前3 d接入病原菌，绿色木霉对茄腐镰孢菌的抑制率达100%，显微镜下可见绿色木霉通过缠绕、寄生等方式使茄腐镰孢菌发生菌丝断裂、缢缩、消解等现象。Naglot等[39]研究表明，绿色木霉菌株SDRLIN1对两种病原菌Pestalotiatheae和F.solani的抑制率分别达到50.51%和63%，是试验所用菌株中效果最好的。Jana和Manda[40]利用分离鉴定的绿色木霉菌株与白绢病病菌共同培养，结果发现绿色木霉菌株T10完全抑制了白绢病病菌生长。Nawaz等[41]研究表明，绿色木霉可有效抑制辣椒疫霉菌菌丝的生长，抑制率高达85.5%，同时在温室环境中种植辣椒时，配合根施绿色木霉菌剂的处理较空白对照组可以降低植株根腐病发病率达24%～26.5%。

绿色木霉代谢过程中会产生倍半萜烯类、类固醇类以及烷基吡喃酮等抑菌物质。研究发现该菌在无土培养基上会分泌绿胶霉素和胶霉毒素，而这两种代谢产物均对植物有显著抑菌作用[42]。胶霉菌素是一种具有毒副作用的次级代谢产物，其特有的二硫键桥结构可与胞内活性蛋白分子发生交联从而抑制酶的生物活性，胶霉菌素对水稻纹枯病、小麦枯萎病等土传病原菌均有广谱抗菌性[43]。王勇等[44]发现，绿色木霉菌丝体在液体发酵过程中胞外愈创木酚氧化酶和多酚氧化酶活性呈现缓慢曲线式上升，这两种酶具有抗植物病原真菌活性，表明绿色木霉对病原菌的抗性逐渐增强。

不同病原菌对绿色木霉代谢产物的敏感性不同，并且绿色木霉挥发性代谢产物和非挥发性代谢产物对马铃薯炭疽菌、镰刀菌、立枯丝核菌的抑制效果存在差异，挥发性代谢产物对三种病原菌的抑制率显著高于非挥发性代谢产物[45]。Valenzuela等[46]研究发现芒果接种绿色木霉24 h后，致病菌炭疽菌的生长明显受到抑制，抑制率高达77.4%。气相色谱-质谱分析表明其挥发性代谢产物主要是苯甲醇、2-苯乙醇、6-戊基-2H-吡喃-2-酮等有机化合物[47]。Kumari等[48]研究绿色木霉抗菌机制时发现，生物合成的银纳米粒子比化学物质对病原菌的抑制性更强。

大量试验表明，绿色木霉代谢产物对串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、茄链格孢菌(Alternariadauci)、杯盘菌(Ciboriaspp.)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpulluans)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)和根霉(Rhizopus)等植物病原菌均有明显拮抗效果[34,49]。此外，绿色木霉次生代谢产物中某些胞外蛋白酶也对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)卵孵化产生高度抑制，降低植物病虫害发生率[50]。Al-Hazmi等[51]研究发现，给番茄浇灌不同浓度绿色木霉和哈茨木霉(Trichodermaharzinum)菌液，不仅能有效抑制根结线虫病的发病率，还会促进番茄生长。

2.2 绿色木霉对植物免疫的诱导

诱导抗病性是指利用物理、化学以及生物学方法对植物进行预处理，从而增强植物自身抗性，改变植物对病虫害的反应[52]。目前关于绿色木霉对植物病原菌的抗性及其机理研究较为广泛，而对绿色木霉诱导植物抗病代谢的研究相对较少。

绿色木霉可以通过诱导植物防御酶系的变化增强植物抗性。经绿色木霉发酵液处理后，小麦体内苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等防御酶均出现活性高峰；该发酵液能够抑制小麦丝核菌多聚半乳糖醛酸酶活性，造成寡聚半乳糖醛酸酐积累，使植物相关抗性代谢增强，激发植物防御反应[53]。辛鑫等[54]发现绿色木霉和香蕉枯萎病病原菌的接种顺序对诱导香蕉组培苗抗性具有显著影响，在先接种绿色木霉后接种病原菌时，香蕉组织内苯丙氨酸酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等防御酶活性明显升高。Gajera等[55-56]发现经绿色木霉处理后花生幼苗颈腐病发病率降低了51%～58%，接种绿色木霉后诱导的抗氧化防御反应对因黑曲霉引发的根腐病有显著抑制作用。

2.3 绿色木霉对植物生长的促进作用

近年来研究发现，绿色木霉和哈茨木霉不仅对植物病原菌有拮抗作用，还能提高种子活力和萌发率，促进幼苗生长[57-59]。有研究指出，经过木霉处理的马铃薯(Solanumtuberosum)、小麦(Triticumaestivum)、烟草(Nicotianatabacum)、胡萝卜(Daucuscarota)、长春花(Catharanthusroseus)、菊花(Dendranthemamorifolium)、辣椒(Capsicumfrutescens)和玉米(Zeamays)，其种子萌发和植株生长均有不同程度提高，具体表现为提高植物种子活力、发芽率、出苗率、根系活力、株高及植株干质量等[60-63]。李艳娟等[64]研究表明，不同浓度的绿色木霉和哈茨木霉溶液对杉木(Cunninghamialanceolata)种子萌发和幼苗生长有促进作用，并能通过提高幼苗抗氧化酶活性，增强杉木幼苗抗逆性。Arun等[65]将绿色木霉发酵木薯块茎固体废物得到的生物有机肥分别与磷细菌、固氮菌回接到秋葵(Abelmoschusesculentus)上，发现堆肥与磷细菌共同作用能够显著提高植株叶绿素含量及秋葵产量，且接种堆肥的秋葵植株不被根腐病感染。同时，绿色木霉活性有机肥能够显著降低碱性土壤pH值，有效抑制氨挥发，并与土壤微生物群落互作增强硝化作用，提高作物对氮肥的利用效率[66]。Singh等[67]研究表明，利用假单胞菌、绿色木霉和哈茨木霉菌剂不仅能有效防治水稻鞘枯萎病，还能促进水稻生物量的积累。Lee等[68]研究发现，木霉属多个菌株都对番茄有促生作用，其中绿色木霉对番茄总生物量和侧根生长有显著促进作用。Joshi等[69]研究表明，从喜马拉雅地区土壤分离的绿色木霉菌株回接到植株后，其根系和株高显著高于空白处理。

就目前研究结果而言，木霉可能的促生机制主要包括：木霉可产生植物生长调节剂，对外源植物激素起到双向调节作用[70-71]；木霉能抑制或降低植物根际周围有害菌群产生的有利于自身生长但对植物生长有抑制作用的化合物[72]；木霉产生的有机酸、螯合剂、还原酶等，能够增加植物对养分的利用率，促进植物生长[73-74]。

3 展 望

绿色木霉在农业、资源再利用和环境修复领域具有广阔应用前景。近年来国内外关于绿色木霉在生物防治、生物发酵、生态修复等方面的研究报道很多，但多局限在实验室条件下，大规模应用研究较少。绿色木霉生长和繁殖受环境因素影响较大，因此近年来研究人员利用基因工程提高绿色木霉对不利环境的适应性以及多种水解酶的表达量，这样能极大提高绿色木霉生存生长以及生物防治能力，为大规模应用绿色木霉提供了保障[8,75-76]。

我国每年因农作物病虫害导致粮食减产3.53%，损失约1 966 万吨。绿色木霉是当前应用广泛的广谱抗生菌之一，对多种植物病原菌具有明显防治效果，并能促进植株生长[77]。因此，充分开发利用绿色木霉生防菌资源对缓解粮食危机和防治农业污染具有重要意义。农作物秸秆和中药药渣是重要的可再生生物资源，其主要成分是纤维素，作为一个农业大国，我国拥有丰富的纤维素资源，占世界总量的20%～30%，而我国的秸秆和中药药渣再利用率并不高，多被自然腐败或燃弃，造成了严重的环境污染。尤其是近年来雾霾问题日益突出，运用生物降解法综合利用农作物秸秆、中药药渣等废弃物的优越性逐渐显现，绿色木霉高效的纤维素降解能力体现出了巨大的经济和生态价值[2,76]。此外，绿色木霉还具有促进植株生长、降低重金属污染以及生物转化提高次生代谢产物等多种对人类有益的生物功能[78-79]。因此，未来尚需加强对以下领域的深入研究：①深化基础理论研究，阐明诸如绿色木霉-植物有益互作所诱导的植物抗性机制等。②筛选高效绿色木霉菌株，最大限度提高其生物降解和生物防治功能。③利用分子生物技术及基因工程等手段，选育、驯化、培养绿色木霉菌株，特别是应用基因工程技术得到基因工程菌，获得能够高效产酶和生物降解的优良菌种。④进行绿色木霉与其他有益微生物、环境有机残渣的组合研究，强化绿色木霉促生和生态修复效果。⑤自然环境条件较实验室条件更为复杂，从实验室得出的研究成果可能并不完全适用于自然生境。因此，应加强自然条件下的试验研究，以便尽快实现绿色木霉工程化应用。